鹿角補骨顆粒改善大鼠骨代謝及急性毒性檢測的研究

師偉 高毅* 徐麗 王舒 王亞美 馬莉莉 陳小雪 張濤 曾令青

1. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014 2. 山東省立醫(yī)院，山東 濟南 250000 3. 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”范疇，中醫(yī)認為“腎藏精，主骨、生髓”，腎虛是骨質(zhì)疏松癥的主要病機，治療上以補益肝腎為主。現(xiàn)代研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)[1]，補腎類中藥在提高骨密度、改善骨質(zhì)疏松癥狀、調(diào)節(jié)激素水平及骨代謝方面的作用療效顯著。

現(xiàn)選具有補腎作用的中藥鹿角補骨顆粒進行研究。鹿角補骨顆粒為高毅教授治療骨質(zhì)疏松的臨床驗方，療效確切，經(jīng)提取加工制成顆粒劑。鹿角補骨顆粒原名溫腎壯骨方，前期實驗研究[2-4]已經(jīng)證實該方能夠緩解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀，起到預防骨量丟失的作用?，F(xiàn)對鹿角補骨顆粒對大鼠骨代謝及急性毒性進行研究，檢測該方對大鼠骨代謝的影響及急性毒性，為臨床用藥療效性、安全性提供依據(jù)。

1 骨代謝實驗

1.1 材料與方法

1.1.1實驗動物：5周齡wistar大白鼠60只，雌雄各半，體重110～120 g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。動物合格證號為：SCXK(魯)20140007(37009200003437)。

1.1.2實驗試劑：大鼠血清Ⅰ型前膠原氨基末端前肽(PINP)試劑盒、骨鈣素(BGP)試劑盒、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX)試劑盒，北京冬歌生物科技有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備：酶標分析儀，安圖實驗儀器(鄭州)有限公司。

1.1.4實驗藥品：鹿角補骨顆粒用蒸餾水配成2.5 g/mL藥液備用，由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.5實驗方法：將大鼠隨機分為三組，每組20只(雌雄各10只)，雌雄分開，觀察一周，大鼠體重、進食、糞便、活動等情況均無異常，然后開始灌胃給藥。每7天測一次體重，按體重變化調(diào)整給藥量，每天分1～2次灌胃給藥，每周給藥6 d，連續(xù)180 d，并觀察動物活動、毛色糞便、進食體重變化等情況。用藥結(jié)束后，每組取14只大鼠(雌雄各半)，水合氯醛麻醉，進行大鼠血清Ⅰ型前膠原氨基末端(PINP)、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX)含量檢測。進行組間統(tǒng)計學處理。高劑量組：按人用量40倍(92.0 g/kg)每天定時灌胃。低劑量組：按人用量10倍(23.0 g/kg)每天定時灌胃。對照組：按鼠重給等體積蒸餾水灌胃。

1.2 實驗結(jié)果

PINP：高劑量組和低劑量組含量均高于空白對照組(P<0.05)，且高劑量組高于低劑量組(P>0.05)；BGP：高劑量組和低劑量組含量均高于空白對照組(P>0.05)；CTX：高劑量組低于低劑量組(P>0.05)，高劑量組、低劑量組均高于空白組(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 各組大鼠骨代謝測定結(jié)果Table 1 Bone metabolic markers in each group

注：以下圖1、2、3分別為高劑量組，低劑量組，空白組。

Note： The following charts 1, 2, 3, respectively, high-dose group, low-dose group, blank group.

圖1 大鼠PINP測定結(jié)果，高劑量組大鼠血清PINP含量高于低劑量組，都高于空白組。Fig.1 The results of rat PINP assay showed that serum PINP level in the high-dose group was higher than those in the low-dose group, and both were higher than that in the blank group.

圖2 大鼠BGP測定結(jié)果：高劑量組大鼠血清BGP含量高于低劑量組，均高于空白組。Fig.2 The result of rat BGP showed that the content of BGP in the high dose group was higher than that in the low dose group, and both were higher than that in the blank group.

圖3 大鼠CTX測定結(jié)果：高劑量組大鼠血清CTX含量高于低劑量組，都高于空白組；隨著用藥劑量的增加，高劑量組大鼠血清CTX含量較低劑量組有下降趨勢。Fig.3 The results of CTX assay showed that the content of serum CTX in the high dose group was lower than that in the low dose group, but CTX in both dose groups was higher than that in the blank group. With the increase in dose, the CTX content in the high dose group decreased.

2 急性毒性實驗

2.1 實驗動物

SPF級昆明種小白鼠50只，體重18～22 g，雌雄各半，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號SCXK(魯)20140007(37009200001685)。

2.2 實驗藥物

鹿角膠補骨顆粒(由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供)，按常規(guī)煎藥方法煎煮，鹿角膠烊化，然后濃縮至1.94 g/mL,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法

以一日內(nèi)最大耐受實驗法，將40只小鼠，隨機分為兩組，每組20只，雌雄各半并分開飼養(yǎng)，禁食12 h后，一組給鹿角膠補骨顆粒1.2 mL/20 g灌胃，另一組給同體積水，連續(xù)觀察七天。

2.4 結(jié)果

給藥后小鼠外觀毛色光亮，行為活動正常，無異常病理性神經(jīng)反射出現(xiàn)，七天中進食良好，無便稀，無血尿等其它異常表現(xiàn)，并無一死亡。體重變化與對照組相比無明顯差異，見表2。

表2 急性毒性實驗

3 討論

骨骼以骨重建的方式不斷進行新陳代謝，骨重建由成骨細胞、破骨細胞和骨細胞等組成的骨骼基本多細胞單位完成[5]。當破骨細胞活性大于成骨細胞的活性時，骨溶解大于骨吸收，造成骨質(zhì)流失，進而導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。骨基質(zhì)90%是由 I 型膠原組成，其合成與分解的代謝產(chǎn)物可間接反映骨轉(zhuǎn)換的情況。PINP 作為I型前膠原蛋白的兩種前肽之一，在血清中的含量反映成骨細胞合成骨膠原的能力，是反應骨形成的重要標志物[6-7]。CTX是由I 型膠原降解的產(chǎn)物，反應了破骨細胞的活性，是骨吸收的重要指標[7-8]。BGP主要由成骨細胞、成牙質(zhì)細胞和肥大軟骨細胞合成分泌，BGP是骨基質(zhì)中最重要的一種特異性非膠原蛋白，BGP產(chǎn)生后一部分吸收進入骨基質(zhì)，另一部分釋放進入外周血。其生理功能是調(diào)節(jié)和維持骨鈣，維持正常骨礦化，抑制異常羥基磷灰石結(jié)晶的形成。骨鈣素是評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標[9-11]。

鹿角補骨顆粒由鹿角膠、熟地黃、骨碎補、淫羊藿、枸杞子、杜仲、當歸、蛇床子、木香等組成。方中以鹿角膠、骨碎補為君藥，益精養(yǎng)血，溫補腎陽，益精填髓的作用；淫羊藿、菟絲子、杜仲、熟地黃、白芍、枸杞子為臣藥，補肝腎、強筋骨，益精填髓同時發(fā)揮白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛的功效。當歸、木香、蛇床子為佐藥，溫腎壯陽、養(yǎng)血行氣。諸藥合用，陰陽并補，標本兼施，補益陰精同時活血行氣，使補而不滯，協(xié)同作用，共奏補益肝腎，強筋壯骨的功效[4]。實驗結(jié)果表明，鹿角補骨顆粒能明顯提高大鼠PINP、BGP水平，隨劑量增加呈上升趨勢，說明鹿角補骨顆粒能夠增加成骨細胞活性，促進骨形成。鹿角補骨顆粒組大鼠CTX水平較空白組高，高劑量組較低劑量組降低，說明隨服藥劑量增加，鹿角補骨顆粒一定程度上能降低破骨細胞活性，調(diào)節(jié)骨代謝，達到防治骨質(zhì)疏松的作用，并且急性毒性實驗未見小鼠中毒表現(xiàn)。

本研究為鹿角補骨顆粒的療效性、安全性評價提供了科學依據(jù)，為鹿角補骨顆粒在臨床上進一步開發(fā)應用奠定了基礎(chǔ)。同時由于本實驗未對大鼠進行骨質(zhì)疏松造模，觀察時間短，沒有進行骨密度相關(guān)檢測等方面，還存在不足，有待今后進一步研究。