黃連素對(duì)2型糖尿病大鼠大血管病變PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

封 芬，譚安雄，鄧集湘，周 斌

(1.邵陽(yáng)學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000； 2.邵陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖南 邵陽(yáng)，422000)

關(guān)健詞：黃連素；糖尿??；大血管病變；PI3K；Akt

文獻(xiàn)資料顯示，我國(guó)已成為世界第一糖尿病大國(guó)，2013年，成人糖尿病患病率已高達(dá)10.4%[1]。糖尿病大血管病變是指由糖尿病并發(fā)的心、腦血管及外周血管病變，接近65%的2型糖尿病患者死于大血管病變，其病理變化主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能異常和動(dòng)脈粥樣硬化[2]。黃連素(Berberine)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有顯著的降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗等功效[3-5]。據(jù)報(bào)道，黃連素可抑制兔頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生，改善血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用[6]。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中，關(guān)于黃連素對(duì)糖尿病大血管保護(hù)作用的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。近年研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了胰島素信號(hào)的傳遞，高濃度葡萄糖能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Akt和eNOS mRNA表達(dá)[7]。故推測(cè)黃連素有可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路參與糖尿病大血管的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究黃連素對(duì)糖尿病大血管病變PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，為黃連素防治糖尿病大血管病變發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

雄性SD大鼠60只，體重180～200克，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002；普通飼料(粗脂肪7.5%、粗蛋白24.3%、碳水化合物46.5%)；高脂飼料(含1%膽酸、2.5%膽固醇、10%煉豬油、20%蔗糖、66.5%普通飼料)購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(STZ)及黃連素(北京北實(shí)縱橫科技發(fā)展有限公司)；二甲雙胍(山東東方福瑞達(dá)制藥有限公司)；C反應(yīng)蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)；p-PI3Kp85一抗(Cell Signaling Technology公司)；p-Akt(Ser473)一抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；β-actin抗體、PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.3 主要儀器

Sure Step Plus血糖儀(Lifescan公司)，聚丙烯酰胺垂直電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Elx800酶免疫儀(Bio Rad公司)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，超低溫冰箱(三洋公司)，Chemi-Doc-IT610化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(UVP公司)。

1.4 動(dòng)物造模及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，隨機(jī)抽選10只作為正常組，飼喂普通飼料，其余大鼠飼喂高脂飼料。4周后，高脂飼料組大鼠禁食12h后腹腔注射STZ(30mg·kg-1，用pH4.4的0.1mol·L-1檸檬酸緩沖液溶解)，7天后重復(fù)注射一次。正常組在同等情況下腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。2周后，斷尾取血檢測(cè)禁食12h后的空腹血糖(FBG)，以FBG≥7.8mmol·L-1為2型糖尿病大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[8]。將造模成功的大鼠(n=30)隨機(jī)平均分為模型組、黃連素組和二甲雙胍組。模型組以生理鹽水灌胃(10ml·kg-1·d-1)，黃連素組以黃連素灌胃(150mg·kg-1·d-1)，二甲雙胍組以二甲雙胍灌胃(200mg·kg-1·d-1)，繼續(xù)喂養(yǎng)8W。

1.5 標(biāo)本收集

藥物干預(yù)結(jié)束后，剪尾采血檢測(cè)FBG。然后腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40mg·kg-1)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血4～5ml，低溫高速離心后取血清，于-80℃保存。取血之后立即分離胸主動(dòng)脈，剪成兩段，分別于HE染色和-80℃保存。

1.6 空腹血糖及血清C反應(yīng)蛋白的檢測(cè)

用血糖儀檢測(cè)大鼠FBG，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。

1.7 形態(tài)學(xué)觀察

將大鼠胸主動(dòng)脈用10%中性甲醛固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸蠟，石蠟包埋，按4μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光鏡下察看其形態(tài)學(xué)變化。

1.8 胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85、p-Akt表達(dá)檢測(cè)

取大鼠胸主動(dòng)脈，加入RIPA裂解液(10μl·mg-1)和PMSF(1μl·mg-1)，于冰浴條件下勻漿，而后4℃，12000r·min-1離心5min，去除沉淀，按BCA試劑盒操作檢測(cè)蛋白總量。取50μg蛋白加入上樣緩沖液，加熱變性，然后在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳(濃縮膠為80V恒壓，分離膠為120V恒電)。半干式電轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，在室溫下輕搖2h后加入一抗4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后(每次10min)加入二抗，37℃孵育45min。經(jīng)TBST洗膜3次后(每次20min)，于暗房?jī)?nèi)加ECL發(fā)光劑，曝光、顯影、成像。用Image J圖像分析軟件分析免疫印跡結(jié)果，以β-actin蛋白灰度值為參考，計(jì)算p-PI3Kp85、p-Akt的相對(duì)含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠生長(zhǎng)良好，毛皮光澤，自主活動(dòng)正常，無(wú)死亡。模型組大鼠毛皮枯黃，萎靡少動(dòng)，飲食飲水增加，小便排泄增多。黃連素組及二甲雙胍組大鼠用藥干預(yù)后，糖尿病癥狀明顯減輕，精神狀態(tài)良好，皮毛潤(rùn)澤，自主活動(dòng)無(wú)異常。

2.2 大鼠FBG及血清CRP水平

與正常組比較，模型組FBG及CRP水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃連素組及二甲雙胍組FBG及CRP水平明顯降低(P<0.01)。黃連素組與二甲雙胍組的FBG及CRP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)表1。

組別劑量/(mg·kg-1)FBG/mmol·L-1CRP/mg·L-1正常組 —4.62±0.291.34±0.11模型組 —13.54±0.21*2.78±0.18*二甲雙胍組2008.01±0.42△1.88±0.14△黃連素組 1508.9±0.38△1.91±0.15△

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，△P<0.01

2.3 大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)學(xué)觀察

正常組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，中膜層平滑肌細(xì)胞排列整齊。模型組內(nèi)膜斷裂不平整，連接間隙增大，內(nèi)皮細(xì)胞有壞死脫落。與模型組相比，黃連素組及二甲雙胍組各層細(xì)胞排列較規(guī)則，內(nèi)膜較光滑平整，內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)壞死脫落，病變明顯減輕,見(jiàn)圖1。

注：A為正常組，B為模型組，C為二甲雙胍組，D為黃連素組圖1 黃連素對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響(HE染色，×200)Fig.1 The effect of berberine on the histological morphology of rats’ thoracic aorta by HE staining(×200)

2.4 大鼠胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示各蛋白與β-actin的分析光密度平均比值中，與正常組相比，模型組胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，黃連素組和二甲雙胍組胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達(dá)明顯增高(P<0.01)；黃連組和二甲雙胍組p-PI3Kp85、p-Akt的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01圖2 黃連素對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表達(dá)的影響±s，n=10)Fig.2 The effects of berberine on protein expression of p-PI3K p85 and p-Akt by western blot analysis in rats’aorta(±s，n=10).*P<0.01vs normal group;△P<0.01vs model group

3 討論

糖尿病血管并發(fā)癥主要表現(xiàn)為全身的血管損害，包括微血管病變和大血管病變，是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥。糖尿病血管并發(fā)癥的嚴(yán)重程度直接關(guān)系到糖尿病患者的預(yù)后及生活質(zhì)量。因此，深入研究糖尿病大血管病變的發(fā)生機(jī)制，對(duì)于控制和延緩其病理過(guò)程意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)，結(jié)合小劑量STZ腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型[8]。此種造模方法操作較為方便，成模時(shí)間較短，可重復(fù)性較好，廣泛用于2型糖尿病發(fā)病機(jī)理的相關(guān)研究。在實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠出現(xiàn)了典型的多食、多飲、多尿等糖尿病癥狀，黃連素組應(yīng)用黃連素灌胃治療干預(yù)后，上述癥狀明顯減輕。

黃連素又稱(chēng)為小檗堿，屬于異喹啉類(lèi)生物堿，可從中藥黃連、黃柏等提取，臨床上一直作為非處方藥用于治療腹瀉。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃連素在內(nèi)分泌、心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示出有益的藥理活性及功效[9]。據(jù)報(bào)道，黃連素能顯著降低空腹血糖，通過(guò)抑制肝糖異生作用，改善糖尿病大鼠糖代謝[10]。Wang J等發(fā)現(xiàn)，黃連素短期應(yīng)用可通過(guò)局部抑制腸DPP-Ⅳ而降低STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型FBG及餐后2h血糖[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連素組大鼠FBG水平明顯低于糖尿病組，說(shuō)明黃連素灌胃治療干預(yù)后，能有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖(P<0.01)，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致。

C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CPR)是一種非糖基化的聚合蛋白，它的生物學(xué)作用主要包括識(shí)別和結(jié)合內(nèi)源性異物、激活補(bǔ)體、調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞活性等，為非特異性的炎癥標(biāo)記物，是炎癥急性期時(shí)最靈敏的指標(biāo)之一。Lowe G等認(rèn)為，炎癥因子水平紊亂是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的重要誘因[12]。研究表明，血清CRP水平與糖尿病大血管病變之間存在著明顯的相關(guān)性，高血糖及高血脂可通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，引起內(nèi)皮功能損傷，使CRP等相關(guān)炎癥因子水平紊亂[13]。據(jù)報(bào)道，黃連素對(duì)軟脂酸引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，并可能與上調(diào)eNOS、促進(jìn)NO生成有關(guān)[14]。諸多研究顯示，黃連素在保護(hù)血管方面有積極意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，模型組大鼠血清CRP水平顯著增高(P<0.01)，HE染色顯示大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜受損，提示糖尿病模型大鼠大血管出現(xiàn)炎性病變。黃連素組用黃連素干預(yù)治療8周后，大鼠血清CRP水平明顯低于模型組(P<0.01)，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜病變也輕于模型組，提示黃連素能有效減輕血管炎性反應(yīng)，在防治糖尿病大血管病變方面有積極作用。

磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)信號(hào)通路參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和細(xì)胞生存、代謝、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)控。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異二聚體[15]，調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基之后，活化催化亞基p110，從而傳導(dǎo)酪氨酸激酶信號(hào)。Akt(蛋白激酶B)是PI3K信號(hào)通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信號(hào)通路在胰島素調(diào)控血糖平衡方面發(fā)揮著重要作用[16]。研究表明，糖尿病患者Akt活化受損，黃癸固體分散體中的有效成份黃連素能上調(diào)Akt活性，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4膜轉(zhuǎn)位，改善胰島素抵抗[17]。徐明國(guó)等報(bào)道，黃連素抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷與激活PI3K/AKT/eNOS途徑有關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組胸主動(dòng)脈p-PI3Kp85、p-Akt的表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)，而黃連素組用黃連素灌胃治療8周后，p-PI3Kp85、p-Akt的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01)。基于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)的初步研究結(jié)果認(rèn)為，黃連素能降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖，改善大血管病變的病理過(guò)程，對(duì)糖尿病大血管具有保護(hù)作用，此作用機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

糖尿病大血管病變所涉及的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)僅初步探討了黃連素對(duì)糖尿病大鼠大血管PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，其中各項(xiàng)指標(biāo)間的因果聯(lián)系還待研究。此外，黃連素對(duì)糖尿病大血管的保護(hù)作用是否涉及到其他機(jī)制也需要進(jìn)一步的探索，以期為2型糖尿病大血管病變的防治用藥提供更廣泛的思路空間。