響應(yīng)面在加拿大一枝黃花揮發(fā)油提取中的應(yīng)用

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州，221006)

加拿大一枝黃花屬菊科多年生草本植物，原產(chǎn)北美，于1935年作為觀賞性植物引入我國[1]。最初在上海、南京等南方地區(qū)栽培。因花色澤靚麗，常用于插花中的配花。而后因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境適宜，沒有約束、管理，逐漸在農(nóng)田的拋荒地、建筑工地、果園以及田邊地頭、鐵道兩邊、河邊河灘等蔓延開來，一發(fā)不可收拾，嚴(yán)重破壞了當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，并對(duì)物種多樣性構(gòu)成嚴(yán)重威脅?，F(xiàn)在浙江、安徽、江蘇、福建、江西、四川、山東、河南、湖北、湖南、廣西、廣東、海南、重慶、貴州、云南等17個(gè)省市都出現(xiàn)了加拿大一枝黃花的蹤影。當(dāng)?shù)夭块T抓緊開展了鏟除、焚毀加拿大一枝黃花的行動(dòng)，并嚴(yán)令禁止種植、運(yùn)輸、買賣等活動(dòng)。

雖然加拿大一枝黃花是外來入侵物種，但其功效也不少，是一種有用的資源。加拿大一枝黃花中含有多炔類、二萜、皂苷類、黃酮類、苯丙酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分，有抗氧化、抗炎、抗菌、利尿、抗腫瘤等作用[2]。在國外就認(rèn)定其有一定藥用價(jià)值，被允許全草入藥。對(duì)糖尿病、慢性腎病、風(fēng)濕病等疾病的治療就有很好的療效，可作為抗炎劑使用。根據(jù)它的抗氧化活性，可以將其作為抗生素、外激素等化學(xué)制劑的代用品，因此用其研制一些護(hù)膚品、化妝品等。使用最多的還是它的揮發(fā)油。加拿大一枝黃花的根、莖、葉和花都可以提取揮發(fā)油。利用它的抗菌效果可以制作手工皂，特別對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有效，對(duì)金黃色葡萄球菌也有一定療效。

此試驗(yàn)主要采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選萃取加拿大一枝黃花揮發(fā)油的條件。響應(yīng)面可以直觀地判別優(yōu)化區(qū)域，觀察其最優(yōu)化點(diǎn)，找出最優(yōu)值。將體系的響應(yīng)(如萃取率)作為一個(gè)或多個(gè)因素(如萃取劑濃度、酸度等)的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來[3]。本試驗(yàn)主要采用了三因素三水平的方法共設(shè)17個(gè)實(shí)驗(yàn)，建立多元線性回歸方程繪出三維圖形，得出最優(yōu)提取方法。

1 提取揮發(fā)油所需材料和儀器

1.1 材料

加拿大一枝黃花(采自安徽省黃山市)，經(jīng)鑒定加拿大一枝黃花為菊科植物加拿大一枝黃花的干燥根莖，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國藥典》2015版的各項(xiàng)規(guī)定。

蒸餾水，為實(shí)驗(yàn)室自制的蒸餾水，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015版的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 儀器

DF-101T-5L磁力攪拌器(力辰科技)、DZF-6020A真空干燥箱(力辰科技)、600W-900W超聲波發(fā)生器(深圳市廣源達(dá)公司)、TY-8L粉碎機(jī)(天宇機(jī)械)。

2 方法

2.1 加拿大一枝黃花揮發(fā)油的制備

在容器中加入水，將洗凈、干燥的加拿大一枝黃花根據(jù)需要粉碎，放入蒸餾水中；容器的外壁連接換能器振子或?qū)⒄褡用芊庥诓讳P鋼盒中投入容器中，開啟超聲波發(fā)生器。

2.2 揮發(fā)油空白回收率的測(cè)定

用移液器精密量取揮發(fā)油2mL，轉(zhuǎn)移至1000mL燒瓶中，加蒸餾水400mL，同時(shí)加入少量碎瓷片，連接揮發(fā)油測(cè)定器。平行測(cè)定3次，結(jié)果分別為0.89,0.90,0.92mL。計(jì)算空白回收率為90.33%[4]。空白回收率=平均得油量/揮發(fā)油投入量×100%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)選定超聲時(shí)間28.45min，40,51min，55min;提取溫度36.34℃,45,53℃,66℃；pH值:5,7,9為影響值，并用1、0、-1為替代值，考察對(duì)揮發(fā)油萃取率的影響。并根據(jù)效應(yīng)面的星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理設(shè)3個(gè)因素的3個(gè)水平，共取17份樣本進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.4 模型擬合與方差分析

以提取率Y為因變量，超聲時(shí)間A,萃取溫度B,pH值C為自變量，對(duì)實(shí)驗(yàn)最終所取得的數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert 10(32-bit)軟件進(jìn)行擬合，通過相關(guān)系數(shù)(r)來判斷對(duì)模型的擬合程度[5]。用二項(xiàng)式和多元線性回歸的方法來進(jìn)行擬合并用ANOVA進(jìn)行分析。方差結(jié)果見表3。

由表3分析可得，二次回歸方程模型P=0.0042，為顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)P=0.1184，為不顯著(P>0.05)。運(yùn)用陳建中等在《響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙水相萃取大吳風(fēng)草總黃酮工藝及抑菌活性測(cè)定》中所用方法[6]，通過該模型的方差分析可知，因素B(P=0.3374)和因素C(P=0.4918)對(duì)萃取率Y的影響不顯著，而因素A(P=0.0068)對(duì)萃取率Y的影響極顯著，即提取溫度和pH值對(duì)揮發(fā)油的萃取率影響不顯著，而超聲時(shí)間顯著影響了揮發(fā)油的萃取率。各因素對(duì)加拿大一枝黃花揮發(fā)油影響的效應(yīng)大小依次為超聲時(shí)間>提取溫度>pH值。通過回歸模型進(jìn)行擬合，超聲時(shí)間、提取溫度、pH值這三個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響可用以下多元二項(xiàng)式表示：

Y=-199.98492+7.05786A+2.19749B+21.17016C+0.010598AB+0.084307AC-0.063799BC-0.096046A2-0.025938B2-1.51319C2。

表1 揮發(fā)油提取工藝試驗(yàn)因素水平表

表2 揮發(fā)油提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 揮發(fā)油提取工藝擬合回歸方程方差分析表

注：*差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01

2.5 效應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測(cè)條件評(píng)價(jià)

通過運(yùn)用Design Expert 10(32-bit)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析匯總，繪制得到預(yù)測(cè)的加拿大一枝黃花揮發(fā)油萃取率與三個(gè)因變量間的等高線和三維效應(yīng)曲面圖(詳細(xì)見圖1、圖2和圖3)。

R1:加拿大一枝黃花揮發(fā)油提取率；A:A超聲提取時(shí)間；B:B提取溫度圖1 超聲提取時(shí)間和提取溫度對(duì)揮發(fā)油提取率影響的等高線和效應(yīng)曲面圖

R1:加拿大一枝黃花揮發(fā)油提取率；A:A超聲提取時(shí)間；C:C pH值圖2 超聲提取時(shí)間和pH值對(duì)揮發(fā)油提取率影響的等高線和效應(yīng)曲面圖

R1:加拿大一枝黃花揮發(fā)油提取率；B:B提取溫度；C:C pH值圖3 提取溫度和pH值對(duì)揮發(fā)油提取率影響的等高線和效應(yīng)曲面圖

如圖1、2、3所示，萃取率的響應(yīng)面開口向下，萃取率和超聲時(shí)間、萃取溫度、pH值3個(gè)因素呈現(xiàn)明顯的函數(shù)制約關(guān)系。隨著各個(gè)因素水平的不斷增加，響應(yīng)值萃取率也在隨之不斷變化，并出現(xiàn)了最大值。A、B、C三個(gè)因素水平增加，萃取率Y也隨之增加；當(dāng)達(dá)到一個(gè)最大值后，萃取率Y就逐漸下降，這個(gè)最大值就是最優(yōu)萃取條件。借助Design Expert 10(32-bit)中多元二次回歸模型對(duì)加拿大一枝黃花揮發(fā)油萃取率進(jìn)行估算，對(duì)二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，預(yù)測(cè)三因素的最佳組合坐標(biāo)Z(0.14285,1,0.456)，及超聲時(shí)間為43min，提取溫度為37℃，pH值為7.45，此時(shí)模型最大預(yù)測(cè)值Y=71.9864%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取加拿大一枝黃花10.00±0.05g，共取3份，按照上述優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，將預(yù)測(cè)值(71.97%)與實(shí)測(cè)平均值(71.963%，RSD為0.23%)進(jìn)行比較，計(jì)算綜合評(píng)分的偏差為0.0097%。詳見表4。

表4 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

注：偏差值=(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)平均值)/預(yù)測(cè)值×100%

3 結(jié)論

3.1 揮發(fā)油提取方法的選擇

制備揮發(fā)油的常用方法有超聲萃取法、水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法等，考慮到操作的可行性及可控性，本試驗(yàn)采用超聲萃取法提取加拿大一枝黃花揮發(fā)油。此方法無需高溫，常壓萃取，安全性好，操作簡(jiǎn)單易行，萃取效率高，具有廣譜性。超聲波萃取對(duì)溶劑和目標(biāo)萃取物的性質(zhì)關(guān)系小，減少能耗。且雜質(zhì)少，有效成分易于分離、凈化。萃取工藝成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著[7]。

3.2 展望

本試驗(yàn)從超聲時(shí)間、萃取溫度、pH值三方面因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，討論了對(duì)加拿大一枝黃花提取利率的影響。試驗(yàn)得超聲時(shí)間為43min，提取溫度為37℃，pH值為7.45時(shí)的條件下提取率最大，提取得到的揮發(fā)油的量最多。因?yàn)榧幽么笠恢S花揮發(fā)油的功效很多，所以這一資源可以更好地應(yīng)用在日用化工、醫(yī)藥、保健品、化妝品等方面，應(yīng)用前景很廣。