腦寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，江蘇徐州，221006)

腦寧膠囊經(jīng)治療血管性頭疼的臨床驗方腦寧湯改制而成，由赤芍，川芎，水蛭，白芷，藁本，紅花，細(xì)辛，白附子八味中藥組成，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效[1]。本制劑在完成組方中各藥材的提取工藝和制備工藝研究的基礎(chǔ)上，采用TLC法對該制劑進(jìn)行定性鑒別，HPLC法進(jìn)行含量測定，建立腦寧膠囊合理可行的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，可為該制劑的現(xiàn)代化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCl0A—VP高效液相色譜儀(日本島津)；DZF-6120恒溫干燥箱(中新醫(yī)療器械有限公司)；FA20413電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ZF-2型紫外分析儀(上海安靈分析儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇(色譜純，北京化工廠)；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸(分析純，北京化工廠)；石油醚、乙醚(分析純，青島海洋化工廠)；芍藥苷(對照品，中國藥品生物制品研究院)。

本試驗中所使用得藥材均符合《中國藥典》(2015版)的相關(guān)規(guī)定，藥材購于亳州賀林飲片廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

通過對三批腦寧膠囊樣品性狀的觀察，可確定腦寧膠囊的性狀為：本品為膠囊，內(nèi)容物為棕褐色粉末；氣略香，味苦、微辛、涼。

2.2 鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取腦寧膠囊的內(nèi)容物約1g，置于錐形瓶(具塞)內(nèi)，加入50mL的甲醇振搖混勻,錐形瓶密塞，浸泡24h,超聲提取30min,放冷至室溫，過濾并棄取初濾液，精密移取續(xù)濾液20mL，將移取的續(xù)濾液經(jīng)中性的氧化鋁柱用20mL的甲醇洗脫，將洗脫液置于水浴上揮干甲醇，揮干甲醇所得殘渣加入乙醇溶解，并定容至10mL,然后用0.45um微孔濾膜將上述溶液過濾，棄去初濾液，將續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定芍藥苷對照品適量，用無水乙醇將精密稱定的芍藥苷對照品配置成濃度為2mg /mL的乙醇溶液，將上述溶液作為實驗的對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

取缺少赤芍的樣品0.5g，置于具塞錐型瓶中，加入乙醇25mL，按照樣品的制備方法依法制得陰性對照品溶液。

2.2.4 薄層層析條件

薄層板采用硅膠G板，點樣量為10uL，將點樣后的薄層板在三氯甲烷一乙酸乙酯一甲醇一甲酸(40∶5∶10∶0.2)的展開劑中展開后，將薄層板取出待薄層板晾干后，用5%的香草醛硫酸溶液作為顯色劑均勻噴灑在薄層板表面[2]，再將薄層板加熱直到薄層板上出現(xiàn)清晰的斑點。經(jīng)觀察供試品色譜中出現(xiàn)了與對照品色譜相同藍(lán)紫色顏色的斑點，并且出現(xiàn)的斑點距點樣原點的距離相同。

2.3 檢查

2.3.1 水分

取腦寧膠囊內(nèi)容物適量，按照《中華人民共和國藥典》(2015版)四部測定水分含量(%)。結(jié)果見表1。

表1 樣品的水分檢查結(jié)果

2.3.2 裝量差異

依《中華人民共和國藥典》(2015版)四部中關(guān)于膠囊劑的裝量差異的檢查方法取三批腦寧膠囊各20粒檢查裝量差異，根據(jù)重量差異結(jié)果表明：三批樣品均未超出10%的重量差異限度，符合重量差異的限度要求。

2.3.3 崩解時限

依《中華人民共和國藥典》(2015版)中關(guān)于崩解時限檢查中關(guān)于膠囊劑崩解時限的檢查方法取腦寧膠囊6粒測定，應(yīng)在30min內(nèi)全部崩解。結(jié)果見表2。

2.3.4 砷鹽的檢查

分別從三批腦寧膠囊樣品中，稱取膠囊內(nèi)容物粉末1g，加入氫氧化鈣1g混勻，用少量的水將上述粉末調(diào)成糊狀，用小火加熱使上述糊狀物干燥后緩緩至炭化，在500-600℃溫度下慢慢灼燒使樣品至完全灰化后放冷至室溫，在上述樣品中分別加入蒸餾水5 mL，鹽酸5mL，溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至比色管中。按照砷鹽檢查法《中華人民共和國藥典》(2015版)四部附錄中砷鹽檢查第一法進(jìn)行檢查，結(jié)果表明三批的供試品溶液的顏色均淺于對照品的顏色，結(jié)果符合相關(guān)規(guī)定，檢查結(jié)果見表3。

表2 崩解時限檢查結(jié)果：時間(min)

表3 三批樣品砷鹽的檢查結(jié)果

2.3.5 微生物限度檢查

取三批腦寧膠囊，各取腦寧膠囊內(nèi)容物10g,依《中華人民共和國藥典》(2015版)四部中微生物限度檢查法，對腦寧膠囊內(nèi)容物的細(xì)菌、霉菌、大腸桿菌及活螨進(jìn)行測定，測定結(jié)果均符合微生物限度的相關(guān)要求，結(jié)果見表4。

表4 微生物限度檢查結(jié)果

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

日本島津LCl0A—VP高效液相色譜儀，Shimadzu CLASS．VP色譜工作站，

紫外檢測器SPD一10AVP，KQ-250B型超聲波清洗儀(功率250w,頻率40kHZ)，流動相為甲醇-水(1∶3)[3]，流速為1.0ml·min-1，檢測波長為230nm，柱溫為室溫。

2.4.2 供試品溶液的制備

取腦寧膠囊的內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取約1.0g，并放于錐形瓶中，加入甲醇10mL，浸泡4小時后，超聲提取30min，取出、放至室溫，過濾，收集濾液并在水浴60℃蒸干，殘渣中再加入加流動相5mL，超聲處理10min，放冷，過濾，收集濾液并加流動相適量并加至刻度處，定容至10mL，高速離心(r>1500轉(zhuǎn)/分)10min后，放置10min,取上清液，將上述上清液用0.45um的濾膜過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液適量即為實驗的供試品溶液。

2.4.3 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36h的約1.5mg芍藥苷對照品，放置于25mL容量瓶中，加適量的流動相溶解后，在加入使其至刻度，即得濃度為60μg/mL的芍藥苷對照品溶液。

2.4.4 線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取芍藥苷對照品5.6mg，需精密稱定，并置于25mL的容量瓶中，加入甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)溶解芍藥苷并稀釋至容量瓶的刻度。分別精密吸取上述對照品溶液1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL，轉(zhuǎn)移至10mL的容量瓶中，在以上容量瓶中分別加入甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)，稀釋至刻度，制備得到不同濃度的芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)溶液[4]。用進(jìn)樣器吸取上述溶液適量，分別進(jìn)樣20μL并注入液相色譜儀，在波長230nm，流速1.0mL·min-1，流動相采用甲醇-水(1∶3)分別對上述樣品進(jìn)行測定，對得到的系列數(shù)據(jù)，用吸收峰的峰面積作為縱坐標(biāo)，以配置的芍藥苷的濃度作為橫坐標(biāo)。繪制芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=2E+06x+7144,r2=0.998,r=0.99998。結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.4 ug～3.5 ug之間和峰面積具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.4.5 精密度試驗

精密稱取2.2mg的芍藥苷對照品，用少量加甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)溶解后，轉(zhuǎn)移在25mL的容量瓶中，再補足加甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)至刻度。用進(jìn)樣器精密吸取20μL的稀釋液連續(xù)進(jìn)樣5次，通過分析峰面積，計算其精密度，平均值為3135551，RSD為0.13%，結(jié)果表明精密度良好，測定方法比較可靠。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取2.2mg的芍藥苷對照品，用少量加甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)溶解后，轉(zhuǎn)移在25mL的容量瓶中，再補足加甲醇溶液(甲醇∶水=1∶3)至刻度。制備成對照品溶液,分別于0、6、12、24、48h后進(jìn)樣20μL，測得峰面積平均值為，RSD值為0.07%，表明系統(tǒng)至少在48小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號的腦寧膠囊樣品(20170301)內(nèi)容物約0.5g,分別稱取5份，并精密稱定后，并按照含量測定項下的方法進(jìn)行提取和測定，結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性測定數(shù)據(jù)表

試驗結(jié)果分析顯示：采用本方法測定腦寧膠囊含量重復(fù)性較好，RSD為0.82%。

2.4.7 回收率試驗

精密稱取同一批腦寧膠囊(批號20170301)的樣品約0.30g,分別添加芍藥苷對照品溶液(濃度4.53mg/ml)各1mL，按供試品溶液制備方法，制備成加樣回收的供試液，并依法測定，腦寧膠囊內(nèi)容物的五份樣品平均回收率為100.44%，RSD為0.97%，回收率較高，此方法可靠。

2.4.8 供試品含量測定

取腦寧膠囊3批，按含量測定項下操作，結(jié)果見表7。

由以上數(shù)據(jù)分析可得，平均含量為10.28mg/粒，所取三批腦寧膠囊樣品含量測定按降幅20%來計算含量限定值，每粒重按0.5g計算，則每粒腦寧膠囊中芍藥苷的含量應(yīng)不低于8.22mg。

表7 供試品含量測定數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

(1) 在赤芍的鑒定中以芍藥苷為對照品，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸按照40∶5∶10∶0.2的比例混合后的混合溶液作為展開劑，分離效果較好，無陰性干擾。

(2)建立了HPLC法測定腦寧膠囊中芍藥苷的含量，按照要求采用了方法學(xué)考察表明，該種方法能夠控制腦寧膠囊的含量，且精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均為良好，能夠滿足實際質(zhì)量控制的要求。

(3)按照膠囊劑通則對三批中試樣品進(jìn)行了砷鹽、水分檢查、溶出度檢查、微生物檢查等均符合規(guī)定，說明制備工藝可靠，該制劑質(zhì)量可控性良好。