不同注射介質(zhì)對(duì)ICSI后卵子受精與胚胎發(fā)育的影響*

周 樺,何志旭,趙淑云,楊 朝,徐文杰,張 坤, 許文方,呂 晶,潘莉娜,黃官友,周從容,趙孝梅,王星慧

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004)

人卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)注射時(shí)，承載精子的注射介質(zhì)不可避免地會(huì)隨精子注入卵胞漿內(nèi)。目前多數(shù)ICSI手術(shù)采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為注射介質(zhì)，然而PVP本身具有化學(xué)活性，對(duì)卵母細(xì)胞受精、卵裂、胚胎發(fā)育以及對(duì)子代潛在的影響一直為學(xué)界所擔(dān)憂(yōu)。因此ICSI手術(shù)實(shí)施者們采用稀釋的方式盡可能減少PVP的注入量，以減輕PVP的不良影響[1]。本研究比較了ICSI操作中使用PVP、人血清蛋白(HAS)和血清替代品(SPS)作為注射介質(zhì)，對(duì)于ICSI效果的影響，尋求可能取代PVP進(jìn)行ICSI操作的注射介質(zhì)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2018年1月，在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬院接受常規(guī)體外授精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和ICSI-ET治療過(guò)程中患者廢棄的未成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟后按每批成熟卵母細(xì)胞統(tǒng)一一種注射介質(zhì)進(jìn)行ICSI授精，注射介質(zhì)按輪次使用。據(jù)ICSI所用的注射介質(zhì)不同，分為PVP組(3.5% PVP)、HSA組、SPS組?；颊卟辉幸蛩貫檩斅压芤蛩鼗蚰蟹揭蛩?。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所用未成熟卵母細(xì)胞和精子均為患者知情同意后自愿捐贈(zèng)所得。

1.2試劑與材料 實(shí)驗(yàn)所用注射介質(zhì)、人輸卵管液培養(yǎng)基、卵裂培養(yǎng)基、囊胚培養(yǎng)基以及梯度離心液均為Quinn′s產(chǎn)品系列，購(gòu)自美國(guó)SAGE公司；所用培養(yǎng)皿均購(gòu)自美國(guó)BD Falcon公司。

1.3卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 按本中心常規(guī)對(duì)患者進(jìn)行促排卵，艾澤(Merck Serono，德國(guó))250 μg扳機(jī)，34～36 h后采集卵母細(xì)胞。回收的可疑未成熟卵母細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察，未觀察到第一極體的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟，24 h后酶消化去除顆粒細(xì)胞[2]，再次觀察卵母細(xì)胞，將排出第一極體的MⅡ期成熟卵母細(xì)胞納入實(shí)驗(yàn)，按輪次選擇注射介質(zhì)，進(jìn)行ICSI授精。

1.4精子的準(zhǔn)備 體外成熟卵母細(xì)胞行ICSI所用精子為本中心當(dāng)日行IVF-ET的患者授精后剩余的擬丟棄精子。精子處理方式：液化后的精子用梯度離心液處理后再用精子洗滌培養(yǎng)基洗滌，受精用人輸卵管液培養(yǎng)基上游。

1.5ICSI 取上游后的精子加入精子洗滌培養(yǎng)基中，選擇形態(tài)正常、前向運(yùn)動(dòng)的精子進(jìn)行制動(dòng)。將制動(dòng)成功的精子轉(zhuǎn)移進(jìn)入不同注射介質(zhì)的微滴中沖洗后，將精子和盡量少的注射介質(zhì)一同注入卵胞漿，注射后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5%HSA的卵裂培養(yǎng)基微滴中常規(guī)培養(yǎng)。

1.6胚胎培養(yǎng)及胚胎評(píng)級(jí)

1.6.1胚胎培養(yǎng) (1)ICSI后的卵子立即放入卵裂培養(yǎng)基中微滴培養(yǎng)，受精后19～20 h更換新鮮卵裂培養(yǎng)基，觀察受精情況，以出現(xiàn)原核(pronuclear，PN)或雙極體(polarbody，PB)作為受精的標(biāo)志；以同時(shí)出現(xiàn)2PN以及2PB作為正常受精的標(biāo)志[3]；(2)受精卵繼續(xù)培養(yǎng)，授精后66～68 h觀察胚胎卵裂情況，并將所有卵裂期胚胎轉(zhuǎn)移進(jìn)入新鮮的囊胚培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6.2胚胎評(píng)級(jí) 授精后66～68 h觀察卵裂情況。將正常受精并卵裂的胚胎，根據(jù)卵裂球大小是否均勻及有無(wú)碎片等標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)估[4]。本中心將卵裂球≥6-細(xì)胞且≤10-細(xì)胞，評(píng)級(jí)為Ⅰ級(jí)或Ⅱ級(jí)的胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎；授精后144 h觀察囊胚形成情況，并根據(jù)Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行囊胚評(píng)估。

1.7計(jì)算方法 受精率=(1PN+2PN+多PN+2PB)受精卵數(shù)/MⅡ卵子數(shù)×100%；正常受精率=正常受精卵子數(shù)/ MⅡ卵子數(shù)×100%；卵裂率=發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)/總受精卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1患者一般情況 共納入129例不孕患者捐贈(zèng)的共194枚卵母細(xì)胞，3組患者年齡、不孕年限、主要基礎(chǔ)性激素[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteotropic hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)]等參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。3組捐贈(zèng)精子的男性患者的年齡、主要精液常規(guī)參數(shù)[精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)(progressive motility，PR)的精子比例和正常形態(tài)精子比例]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 捐贈(zèng)卵母細(xì)胞者一般情況

表2 捐贈(zèng)精子者一般情況

2.2受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成情況的比較 受精率、正常受精率和卵裂率在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HSA組和SPS組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于PVP組(P<0.05)，但HSA組和SPS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組均有囊胚形成，見(jiàn)表3。各組代表性的優(yōu)質(zhì)胚胎的形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)估見(jiàn)圖1；各組形成的囊胚的形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)估見(jiàn)圖2。

表3 3組卵母細(xì)胞行ICSI后受精、卵裂及胚胎發(fā)育情況

a:P<0.05，與PVP組比較

A：PVP組6-細(xì)胞Ⅱ級(jí)的胚胎；B：HSA組7-細(xì)胞Ⅱ級(jí)的胚胎；C：SPS組8-細(xì)胞Ⅱ級(jí)的胚胎

圖1 3組優(yōu)質(zhì)胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)估(×200,10 μm)

A1：PVP組3BB期囊胚；A2：PVP組2期囊胚；B1：HSA組3BB囊胚；B2：HSA組2期囊胚；B3 和B4：HSA組1期囊胚；C1：SPS組3BB囊胚；C2：SPS組2期囊胚；C3：HSA組1期囊胚

圖2 3組囊胚的形態(tài)學(xué)評(píng)估

3 討 論

由于ICSI需要人為的把精子直接注入卵母細(xì)胞內(nèi)，操作中的化學(xué)接觸不可避免地對(duì)卵母細(xì)胞造成一定程度的損害，其安全性尤其為人們所關(guān)注。PVP是一種人工合成的大分子聚合物，用作ICSI注射介質(zhì)時(shí)，可以明顯降低因ICSI機(jī)械性損傷引起的卵子死亡，常用的PVP濃度為7%～10%。筆者的經(jīng)驗(yàn)是可以將PVP的濃度最低降至3.5%而不影響PVP的使用效果。HSA和SPS都屬于大分子物質(zhì)，可以通過(guò)改變表面張力簡(jiǎn)化對(duì)配子的操作，也可以起到與PVP相似的作用。PVP具有優(yōu)良的生理惰性和生物相容性，但是PVP被注射到卵胞質(zhì)內(nèi)后會(huì)包裹在精子周?chē)?，使精子不容易釋放卵母?xì)胞激活因子，卵母細(xì)胞使精核解聚的物質(zhì)也不能作用于精核，致使精核不能解聚。而且，PVP本身的一些化學(xué)活性，可能會(huì)對(duì)ICSI后卵子受精以及受精卵的后續(xù)發(fā)育造成一定的影響。將人的精子與8.3%PVP共孵育30 min后作掃描電鏡，可以看見(jiàn)PVP造成精子頂體、細(xì)胞膜、和線(xiàn)粒體的膜特征被破壞，精子的核和染色質(zhì)的形狀也會(huì)發(fā)生改變。在對(duì)山羊體外成熟卵母細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PVP對(duì)山羊的卵母細(xì)胞具有毒性，與牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)相比較，PVP會(huì)明顯降低體外成熟卵母細(xì)胞的受精率和卵裂率[6-7]。KATO等[8]發(fā)現(xiàn)，10% 的PVP并不影響牛卵母細(xì)胞的受精率，但是，對(duì)受精卵的后續(xù)發(fā)育有影響，包括減少卵裂率、桑葚胚和囊胚形成率，所形成胚胎的卵裂球數(shù)目明顯減少，并且胚胎中40.9%的卵裂球中仍然可以檢測(cè)出PVP。YARI等[9]發(fā)現(xiàn)，精子暴露在PVP中可以影響受精卵的卵裂以及隨后的胚胎發(fā)育，并且以時(shí)間依賴(lài)的方式產(chǎn)生作用。PVP可誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G2/M期阻滯以及活性氧自由基的形成，并由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，PVP絕對(duì)不能視為完全無(wú)毒。本研究結(jié)果提示，雖然PVP組、HSA組和SPS組3組卵母細(xì)胞的受精率和正常受精率以及卵裂率無(wú)明顯差異，但HSA組和SPS組的卵裂率有高于PVP組的趨勢(shì)，并且PVP組細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于HSA組和SPS組，可見(jiàn)PVP對(duì)ICSI后受精卵的發(fā)育仍然具有不利的影響，本研究與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致。然而也有學(xué)者[10]報(bào)道，當(dāng)PVP的濃度降低到ICSI可以操作的范圍之外時(shí)，會(huì)影響ICSI胚胎的后續(xù)發(fā)育，但是在不影響ICSI操作可控制性時(shí)，低濃度的PVP不會(huì)影響ICSI后胚胎的后續(xù)發(fā)育?？赡苁且?yàn)樯鲜鰣?bào)道是在不同濃度的PVP試驗(yàn)組間的比較得出的結(jié)論，而本研究是在不影響ICSI操作可控制性時(shí)，對(duì)使用PVP和不使用PVP的結(jié)果進(jìn)行比較。

目前輔助生殖技術(shù)中常用的培養(yǎng)基大分子物質(zhì)添加劑為HSA或血清替代物[11]，如SPS。ISAJI等[11]采用BSA替代PVP作為鼠核移植的注射介質(zhì)，結(jié)果表明，與PVP相比，BSA可以顯著提高克隆胚胎體外發(fā)育的速度，增加囊胚形成率，并且還增加了克隆小鼠后代的產(chǎn)量。相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)BSA可以通過(guò)增加組蛋白H3 lysin9和組蛋白H4 lysin12的乙酰化水平來(lái)增強(qiáng)小鼠克隆胚胎的體外和體內(nèi)發(fā)育。目前大多數(shù)的研究報(bào)道認(rèn)為，人胚胎培養(yǎng)基內(nèi)添加HSA或者SPS可以明顯提高人卵母細(xì)胞的受精率、胚胎發(fā)育、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率以及著床率[12-13]。本研究結(jié)果提示，在卵母細(xì)胞的受精率、正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率以及囊胚形成情況等方面，HSA組和SPS組之間并未顯示明顯差異，說(shuō)明HSA和SPS均可作為人卵母細(xì)胞的ICSI注射介質(zhì)。此外，與常規(guī)IVF/ICSI周期以及正常臨床IVM方案獲得的未成熟卵母細(xì)胞相比，本研究中囊胚形成很少(繼續(xù)培養(yǎng)的156枚胚胎中，授精144 h時(shí)僅有9枚囊胚形成)，各組間無(wú)明顯的可比意義，考慮可能為本研究中采用的是常規(guī)促排卵周期中廢棄的未成熟卵母細(xì)胞，其在體內(nèi)時(shí)就已經(jīng)被優(yōu)勢(shì)卵泡中的卵母細(xì)胞所啟動(dòng)的細(xì)胞抑制因子所作用，因此其發(fā)育潛能在采集時(shí)就已經(jīng)降低，從而導(dǎo)致囊胚形成情況較差。

綜上所述，HSA和SPS作為ICSI注射介質(zhì)后，可以取得與PVP相似的受精率、卵裂率和更好質(zhì)量的胚胎，或可作為人ICSI的注射介質(zhì)。值得注意的是，本試驗(yàn)中所用到的患者捐贈(zèng)的未成熟卵母細(xì)胞在常規(guī)IVF/ICSI-ET治療周期中的去向雖然多為丟棄，患者夫婦雙方也簽署了將其用于醫(yī)學(xué)科研的知情同意書(shū)，符合倫理原則，但是由于試驗(yàn)產(chǎn)生的胚胎未能進(jìn)行人體移植，所以胚胎的體內(nèi)發(fā)育潛能并未得到證實(shí)，并且本研究樣本數(shù)量有限，所得結(jié)論可能具有一定的局限性，未來(lái)尚需要擴(kuò)大樣本量并在倫理允許的條件下進(jìn)行體內(nèi)研究方可推廣應(yīng)用。