毛細(xì)管電泳法用于測定大鼠血漿中淫羊藿苷含量的研究

曾 雪，唐 倩，徐穎倩，劉應(yīng)杰，陳 竹，夏培元

(1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院 401331；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科 400050；3.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 401121；4.重慶市化學(xué)藥品質(zhì)量控制與評價協(xié)同評價中心 401121；5.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心，重慶 401331)

淫羊藿屬于小檗科，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、抗衰老、抑制腫瘤和提高免疫力等作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從淫羊藿屬植物中分離鑒定出具有活性的黃酮類化合物106 種，主要是一類以羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯基等為取代基的 2-苯基色原酮衍生化合物。其中淫羊藿苷在人內(nèi)體代謝成淫羊藿苷元，對白細(xì)胞介素(IL)-8和腫瘤壞死因子α(TNF-α) mRNA的產(chǎn)生有一定抑制作用，并促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生促成骨細(xì)胞生長的因子，影響骨細(xì)胞的增殖，提高堿性磷酸酶的活性，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的[1-5]。淫羊藿成分的分析多采用高效液相色譜法(HPLC)，該方法操作步驟多，流動相處理復(fù)雜，試劑量消耗大[6-8]。高效毛細(xì)管電泳(HPCE)作為一種分離分析技術(shù)，具有高靈敏度，高分辨率，緩沖溶液處理簡單，操作簡便等優(yōu)點，有利于開展復(fù)雜生化樣品的分析，目前毛細(xì)管電泳技術(shù)配合不同的測試手段已經(jīng)在天然產(chǎn)物化學(xué)中開展了的以黃酮化合為主的多項研究[9-11]。本文以HPCE為分析方法，以十二烷基磺酸鈉(SDS)為緩沖溶液添加劑，建立檢測血清中淫羊藿苷代謝物含量的方法[12-15]。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，從重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買，給藥前12 h禁食，自由飲水。

1.2儀器與試劑 CL1020高效毛細(xì)管電泳儀(紫外檢測器，中國北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)，GWA-UN1型超純水器(北京普析通用儀器有限公司)，SK-1渦旋混合器(常州國旺儀器制造有限公司)，AUX220電子天平(日本島津)。CQ250 超 聲 波 清 洗 器(上海超聲波儀器廠)，TDG16臺式高速離心機(jī)[屹譜儀器制造(上海)有限公司]。淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(有效純度98.0%,批號14110704,美侖生物科技有限公司)，磷酸(分析純，重慶精細(xì)化工工廠)；2-丙醇(分析純，重慶精細(xì)化工工廠)；乙腈(優(yōu)級純，天津四友化工有限公司)；十二烷基磺酸鈉(SDS，相對分子質(zhì)量272.38，美國)；其他實驗試劑均采用分析純。

1.3方法

1.3.1對照品溶液制備 精密稱取淫羊藿對照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。

1.3.2動物實驗 取6只健康雄性SD大鼠，取對照品溶液灌胃給藥(劑量相當(dāng)于對照品0.2 mg/100 g)，灌胃后分別于0.15、0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h尾靜脈采血0.2～0.4 mL，置于放有肝素的塑料離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ偃?只健康雄性SD大鼠，同法處理收集空白血漿備用。

1.3.3血漿樣品處理 取空白血漿3份約0.5 mL于5 mL塑料離心管中,直接加入對照品溶液100 μL，漩渦混合均勻，分別比較乙酸乙酯萃取-甲醇沉淀、甲醇和乙腈直接沉淀兩種處理血漿的電泳圖，最后確定使用乙酸乙酯萃取法-甲醇沉淀的方法處理血漿。

1.3.4樣品淫羊藿苷濃度測定 采用75 μm×67.4 cm石英毛細(xì)管柱(有效長度51 cm，河北永年瑞豐色譜配件有限公司)；分離電壓20 kV；進(jìn)樣方式采用電動進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓15 kV；進(jìn)樣時間5 s；操作溫度25 ℃；緩沖溶液20 mmol/L磷酸，100 mmol/LSDS(20%乙腈，2% 2-丙醇)，pH2.0，檢測波長254 nm。

2 結(jié) 果

2.1血漿樣品處理方法考察 血漿處理方法有3種，甲醇直接沉淀法，甲醇、乙腈沉淀法，乙酸乙酯沉淀法。甲醇直接沉淀血漿，易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，首先排除。血漿中由于內(nèi)源性干擾物較多，對比甲醇乙腈沉淀法和乙酸乙酯沉淀法，結(jié)果顯示，采用乙酸乙酯萃取后，可明顯減少內(nèi)源性干擾物(見圖1)。故本試驗先采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后采用甲醇沉淀處理，具體操作：取“1.3.2”項下直接加入淫羊藿苷對照品溶液的空白血漿，加入2.5 mL乙酸乙酯,振蕩萃取3 min,離心(5 000 r/min,5 min),移取上清液,于37 ℃水浴氮氣吹干,殘渣加入100 μL甲醇漩渦振蕩1 min溶解,高速離心(10 000 r/min,2 min),取上清液[11-12]。

2.2采血時間的考察 將“1.3.2”項下的大鼠灌胃給藥后血樣按“1.3.3”項下電泳條件進(jìn)樣，以成分峰響應(yīng)值為指標(biāo)，分析考察血藥濃度達(dá)到最大的時間，作為淫羊藿苷代謝物含量測定時間(見圖2)，結(jié)果顯示，給藥后3 h后，血藥濃度達(dá)到峰值。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性試驗 精密吸取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液；實驗方法“1.3.2”項下灌胃SD大鼠血漿樣品和“1.3.2”項下空白血漿各0.5 mL，作為對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液，按實驗方法“1.3.3”項下電泳條件進(jìn)行測定，記錄電泳圖(見圖3)，結(jié)果顯示陰性對照沒有干擾峰，而供試品溶液的出峰時間相比對照品溶液有所后移，分析是因為淫羊藿苷在體內(nèi)代謝成淫羊藿次苷Ⅱ所致。

A:甲醇+乙腈沉淀血漿；B;乙酸乙酯萃取，甲醇沉淀血漿

圖1淫羊藿苷不同處理條件下的血漿HPCE

圖2 6只SD大鼠體內(nèi)不同時間淫羊藿苷電泳峰面積響應(yīng)值

2.3.2線性關(guān)系考察 取5份空白血漿樣品0.5 mL于10 mL塑料離心管中,依次加入實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1 mL漩渦混合均勻,先乙酸乙酯萃取、然后甲醇沉淀，取上清液，得質(zhì)量濃度為0.002、0.01、0.02、0.1、0.2 mg/mL梯度血漿溶液，按實驗方法“1.3.3”項下條件進(jìn)行電泳測定，以淫羊藿苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以電泳峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸計算，得到回歸方程為：Y=127 395X-216 893，r=0.998 7。結(jié)果表明，淫羊藿苷在0.12～2.7 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3精密度試驗 精密吸取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液0.5 mL與實驗方法“1.3.2”項下空白血漿中，按“結(jié)果1”項下方法處理血漿，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定電泳峰面積，計算淫羊藿苷峰面積RSD=1.7%。

A:陰性對照；B:對照品溶液；C:供試品溶液

圖3專屬性試驗

2.3.4重復(fù)性試驗 另取6只健康雄性SD大鼠，取實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液灌胃給藥，并于給藥后3 h進(jìn)行尾靜脈采血，按實驗方法“1.3.2”項下要求進(jìn)行血樣處理，按實驗方法“1.3.3”項下要求進(jìn)行電泳測定，計算淫羊藿苷峰面積的RSD為3.7%。

2.3.5加樣回收率試驗 按實驗方法“1.3.2”項下方法制備6份血漿樣品各0.5 mL，按實驗方法“1.3.3”項下方法進(jìn)行電泳測定，記錄6份樣品淫羊藿苷的電泳峰面積；再依次向6份樣品中加入等質(zhì)量淫羊藿對照品0.2 mg，按實驗方法“1.3.3”項下方法進(jìn)行電泳測定，記錄6份樣品中淫羊藿峰面積，并計算加樣回收率結(jié)果(表1)。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.4含量測定 取3只健康雄性SD大鼠，按實驗方法“1.3.1”項下對照品溶液灌胃給藥(劑量相當(dāng)于對照品0.2 mg/100 g)，灌胃后3 h采血，并按實驗方法“1.3.2”項下方法處理血漿，按實驗方法“2.3.1”電泳條件測定，測得大鼠體內(nèi)淫羊藿苷的含量(見表2)。

表2 大鼠體內(nèi)淫羊藿苷含量

3 討 論

本文研究目的是以HPCE為檢測手段，檢測血清中淫羊藿代謝物的血藥濃度，為淫羊藿的體內(nèi)藥物分析提供新的方法和檢測途徑。

本文的檢測對象是含藥血液樣本，血液中內(nèi)源性干擾物多，如果直接進(jìn)行電泳分析，會導(dǎo)致信噪比降低，目標(biāo)信號被噪音掩蓋，因此血液樣本的前處理是關(guān)鍵，前處理的目的是去除內(nèi)源性物質(zhì)同時不會影響目標(biāo)物的檢測，本文比較了目前常用的3種血液處理方法，最后采用乙酸乙酯萃取血漿，甲醇沉淀的方法，避免樣品乳化現(xiàn)象的同時，降低了內(nèi)源性干擾物影響，有效提高了信噪比。

本文對大鼠采用灌胃方式給藥，淫羊藿進(jìn)入體內(nèi)后受代謝過程影響，血藥濃度呈現(xiàn)連續(xù)變化過程，為了準(zhǔn)確測定淫羊藿血藥濃度，本試驗連續(xù)測定了給藥后12 h的大鼠血藥濃度，確定在灌胃給藥后3 h，血藥濃度達(dá)到峰值，以此時間作為采樣時間，可降低檢測結(jié)果的相對誤差，保證結(jié)果準(zhǔn)確度。

淫羊藿苷給藥后，在大鼠體內(nèi)是以代謝物形式存在，分析代謝物可能是淫羊藿次苷Ⅱ，本文并未采用淫羊藿次苷Ⅱ為對照品，而是采用淫羊藿苷為對照品，比較了淫羊藿苷對照品的電泳圖、空白血清電泳圖和給藥后血清電泳圖，證明了淫羊藿苷在體內(nèi)代謝后僅僅是出峰時間出現(xiàn)延后，但不妨礙定量分析。

淫羊藿苷及其代謝物分子接近電中性，本文在緩沖溶液中加入SDS，調(diào)整pH到2.0，可增加待測組分帶負(fù)點能力，克服緩沖溶液電滲流，利于電泳分離。但加樣回收率試驗RSD偏高，分析原因可能是SD大鼠個體差異、給藥方式等多種因素綜合導(dǎo)致含藥量差異偏大。除此之外，進(jìn)樣方式存在系統(tǒng)誤差，進(jìn)樣量準(zhǔn)確度偏低，最終結(jié)果RSD偏高，后期可通過更改進(jìn)樣方式解決。毛細(xì)管電泳方法簡便，試劑消耗量少，與高效液相色譜相比，不需要對流動相進(jìn)行脫氣和過濾處理，僅采用以磷酸為主的緩沖溶液即可滿足分析要求。在本文中，淫羊藿苷在血漿中的含量隨時間逐漸降低，本文可實現(xiàn)0.12 mg/mL的定量分析，具有較低定量限。同時相比于高效液相色譜，不易堵塞柱子，更適合生化樣本的分析。