兩種染色方法在甲狀腺穿刺細(xì)胞涂片的觀察比較

邱立 溫壽青 高亮 賴吉林

【摘要】 目的：探討蘇木素單染色法在甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片的應(yīng)用效果。方法：回顧性分析2016年1月-2017年12月本院206例甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前用兩種染色制作的細(xì)針穿刺細(xì)胞圖片，分析細(xì)胞學(xué)特征及診斷結(jié)果。結(jié)果：與常規(guī)HE染色涂片比較，蘇木素單染色涂片細(xì)胞背景干凈，細(xì)胞核形態(tài)顯示得更加清晰。蘇木素單染色涂片和常規(guī)HE染色涂片穿刺細(xì)胞學(xué)診斷的陽(yáng)性符合率分別為96.8%、93.8%。結(jié)論：觀察甲狀腺穿刺細(xì)胞涂片時(shí)蘇木素單染色效果優(yōu)于常規(guī)HE染色，有利于診斷。

【關(guān)鍵詞】 蘇木素單染色； 常規(guī)HE染色； 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)

【Abstract】 Objective：To investigate the application effect of hematoxylin single staining in fine needle aspiration cell smears of thyroid.Method：The fine needle aspiration cell images of 206 patients with papillary thyroid carcinoma from January 2016 to December 2017 were analyzed retrospectively. The cytological features and diagnostic results were analyzed.Result：Compared with conventional HE staining smears，the background of smears by hematoxylin single staining were clean and the nucleus characteristics were more clear.The positive coincidence rates of hematoxylin single staining and conventional HE staining in FNAC diagnostic were 96.8% and 93.8%.Conclusion：The effect of hematoxylin single staining on thyroid puncture cell smears is better than that by conventional HE staining，which is helpful for diagnosis.

【Key words】 Hematoxylin single staining； Conventional HE staining； Fine needle aspiration cytology

First-authors address：Baoan District Peoples Hospital of Shenzhen， Shenzhen 518101，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.038

B超引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺涂片細(xì)胞學(xué)（fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）檢查因其具有損傷性小、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)[1-2]，近年來(lái)在臨床得到廣泛開(kāi)展，已經(jīng)成為術(shù)前篩查甲狀腺惡性腫瘤——特別是甲狀腺乳頭狀癌的重要檢查手段[3-4]。目前常規(guī)每例甲狀腺穿刺需要涂3～10張片，隨著臨床送檢標(biāo)本量的不斷增加，細(xì)胞病理診斷醫(yī)師的閱片工作量也不斷增加。如何減輕閱片的壓力，提高檢查的效率以及診斷的準(zhǔn)確性是值得探討的問(wèn)題。本研究通過(guò)蘇木素單染色法和目前在甲狀腺穿刺細(xì)胞涂片較常用的染色法——蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）制作出的涂片效果比較，探討蘇木素單染色法對(duì)顯微鏡下觀察甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞形態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年1月-2017年12月本院行甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查的患者206例的資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后活檢均診斷為甲狀腺乳頭狀癌。其中94例涂片采用蘇木素單染色，112例涂片采用常規(guī)HE染色。男79例，女127例，年齡20～47歲，平均（33.0±0.5）歲。所有患者均因彩超檢查提示甲狀腺結(jié)節(jié)，后由外科醫(yī)生在B超引導(dǎo)下行甲狀腺細(xì)針穿刺術(shù)，多次負(fù)壓吸取細(xì)胞液涂片后送病理科進(jìn)一步制片診斷。

1.2 涂片制備 將細(xì)針穿刺吸取的液體立即均勻涂抹在載玻片上，用注射器吸取過(guò)多的血液，每例涂3～8張片，立即放入95%乙醇溶液中固定15 min。

1.3 常規(guī)HE染色 固定后的涂片流水洗2 min，蒸餾水洗1 min，浸入蘇木素染液10 min，水洗2 min，0.5%鹽酸酒精分化2 s，水洗2 min后浸入1%碳酸鋰溶液返藍(lán)1 min，水洗后浸入伊紅染液10 s，水洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 蘇木素單染色 固定后的涂片流水洗滌2 min，蒸餾水洗滌1 min，浸入蘇木素染液10 min，水洗2 min，0.5%鹽酸酒精分化2 s，水洗2 min后浸入1%碳酸鋰溶液返藍(lán)1 min，水洗后直接梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片[5]。蘇木素及伊紅染液購(gòu)自福州邁新試劑公司。

1.5 細(xì)胞學(xué)觀察及診斷 在顯微鏡下仔細(xì)觀察比較兩種不同染色方法制作的涂片效果，特別是兩種染色法對(duì)顯示腫瘤細(xì)胞形態(tài)的比較以及對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果的影響。按照甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)分六類(lèi)進(jìn)行診斷[6-7]。統(tǒng)計(jì)比較兩種染色法涂片所發(fā)出的細(xì)胞學(xué)診斷與術(shù)后組織學(xué)診斷的陽(yáng)性符合率。陽(yáng)性符合率=陽(yáng)性細(xì)胞學(xué)確診例數(shù)/術(shù)后組織學(xué)確診例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色涂片效果 顯微鏡下觀察，涂片中腫瘤細(xì)胞的胞漿、纖維細(xì)胞胞漿、背景的紅細(xì)胞及膠質(zhì)染成不同程度的紅色，腫瘤細(xì)胞核染成淺藍(lán)-深藍(lán)色。但由于細(xì)胞質(zhì)、紅細(xì)胞及膠質(zhì)等背景染色的干擾，相對(duì)減弱了細(xì)胞核染色在其中的顯著程度，導(dǎo)致一些腫瘤細(xì)胞核特征性形態(tài)的視覺(jué)清晰度有不同程度的降低，見(jiàn)圖1。

2.2 蘇木素單染色法涂片效果 顯微鏡下觀察，涂片中所有上皮、纖維及炎癥細(xì)胞的細(xì)胞漿，背景的紅細(xì)胞以及膠質(zhì)基本呈無(wú)色或僅僅看到模糊的輪廓。上色的只有細(xì)胞核，呈淺藍(lán)-深藍(lán)色。在基本無(wú)視覺(jué)干擾的背景下，腫瘤細(xì)胞核輪廓顯示的突出顯著，核染色質(zhì)也觀察地更加清晰，一些具有診斷價(jià)值的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞學(xué)特征性——特別是核溝、核內(nèi)包涵體更容易尋找和辨認(rèn)，見(jiàn)圖2。

2.3 兩種染色涂片細(xì)胞學(xué)診斷統(tǒng)計(jì)比較 206例術(shù)前甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片標(biāo)本，涂片質(zhì)量合格。穿刺細(xì)胞學(xué)診斷后，所有患者均行甲狀腺部分切除手術(shù)，術(shù)后病理活檢均診斷為甲狀腺乳頭狀癌。整理分析兩種染色涂片細(xì)胞學(xué)診斷情況，見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)得出蘇木素單染色涂片和常規(guī)HE染色涂片穿刺細(xì)胞學(xué)診斷的陽(yáng)性符合率分別為96.8%、93.8%，而“可疑惡性腫瘤”診斷在蘇木素單染涂片和常規(guī)HE染色涂片細(xì)胞學(xué)診斷中的比例分別為2.1%和4.5%。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)甲狀腺乳頭狀癌在我國(guó)的發(fā)病率有不斷上升的趨勢(shì)[8-10]。分析其原因，各種更加先進(jìn)有效的檢查手段逐漸在臨床廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致越來(lái)越多早期或微小甲狀腺乳頭狀癌被發(fā)現(xiàn)，這是導(dǎo)致發(fā)病率上升的一個(gè)重要因素[11-12]。B超引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查因其具有低風(fēng)險(xiǎn)性、高敏感性和高特異性，近年來(lái)在我國(guó)已成為術(shù)前篩查甲狀腺惡性腫瘤——特別是甲狀腺乳頭狀癌最有效的手段[13-14]。隨著這項(xiàng)檢查在臨床的廣泛開(kāi)展，標(biāo)本送檢量也逐年顯著上升。再加上每例甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片少則3張，多則十幾張，這樣就明顯加大了診斷醫(yī)生的工作量。如何在一定程度上減輕醫(yī)生在工作量上的壓力，讓診斷醫(yī)生在切片上更容易尋找和辨認(rèn)出腫瘤細(xì)胞，能更清晰、更容易得觀察到細(xì)胞形態(tài)特征，是值得探討的問(wèn)題。

甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞學(xué)診斷有一定的自身特點(diǎn)，即基本上所有具有診斷價(jià)值的腫瘤細(xì)胞學(xué)特征大部分都體現(xiàn)在細(xì)胞核上[15]，包括核的排列分布特點(diǎn)（如分支真性乳頭結(jié)構(gòu)、指狀突乳頭樣結(jié)構(gòu)、洋蔥皮樣乳頭狀結(jié)構(gòu)、單層細(xì)胞片塊狀結(jié)構(gòu)、核擁擠重疊等）以及核形態(tài)特點(diǎn)（核增大、毛玻璃樣核、瓜子或梭形核、核溝、核內(nèi)假包涵體等）[16-17]。因此如何讓涂片上細(xì)胞核特征更加突出、醒目是制片需要考慮的首要問(wèn)題。本研究通過(guò)蘇木素單染色法與常規(guī)HE染色涂片效果的比較，發(fā)現(xiàn)蘇木素單染色法制做出的甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片在鏡下觀察的效果與常規(guī)HE染色涂片效果相對(duì)比是存在明顯差異的。總結(jié)起來(lái)，蘇木素單染色法主要有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）蘇木素單染色與常規(guī)HE染色涂片效果最顯著的區(qū)別在于前者顯微鏡下觀察的顏色比較單純，沒(méi)有后者色彩那么復(fù)雜。一般在甲狀腺細(xì)針穿刺涂片上除了需要重點(diǎn)觀察的濾泡上皮細(xì)胞外，整個(gè)涂片背景里還常常會(huì)有不定量的紅細(xì)胞、纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、膠質(zhì)等，這些成分在常常會(huì)同濾泡上皮細(xì)胞混雜在一起，以致干擾影響診斷。而蘇木素單染色法僅僅將細(xì)胞核染成藍(lán)色，而這些干擾成分的細(xì)胞漿基本都不上色，因此涂片背景相對(duì)干凈單純?cè)S多，這樣深藍(lán)色的細(xì)胞核在基本無(wú)色的背景下因?yàn)閷?duì)比度鮮明，顯得更為突出醒目，易于在鏡下尋找和觀察腫瘤細(xì)胞。（2）蘇木素單染法制片步驟較常規(guī)HE染色簡(jiǎn)單，省去了伊紅染色等相關(guān)試劑的后續(xù)處理，細(xì)胞受到物理化學(xué)因素的影響相對(duì)較少，因此腫瘤細(xì)胞核的鏡下形態(tài)能相對(duì)保持得更加新鮮完整[18]，特別是核溝、核內(nèi)假包涵體、核皺褶以及核染色質(zhì)淺染等細(xì)微形態(tài)學(xué)特征能更清晰得顯示出來(lái)，有利于鏡下的觀察和辨認(rèn)。蘇木素單染法制作的涂片因?yàn)橹饕炯?xì)胞核，故有時(shí)候會(huì)對(duì)判斷腫瘤細(xì)胞的核漿比造成一定困難。但其實(shí)仔細(xì)觀察，大部分的腫瘤細(xì)胞還是可以看到淺淡的細(xì)胞膜輪廓，對(duì)判斷核漿比沒(méi)有明顯的影響。另一方面也可以通過(guò)與周邊正常濾泡上皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的核做對(duì)比，判斷所要觀察的細(xì)胞核是否增大[19]。

本研究結(jié)果亦顯示蘇木素單染色涂片細(xì)胞學(xué)診斷的陽(yáng)性符合率略高于常規(guī)HE染色涂片診斷的陽(yáng)性符合率，而在診斷“可疑惡性腫瘤”的比例上前者較后者也有所降低。分析病理醫(yī)師做出“可疑惡性腫瘤”診斷的原因，常常是因?yàn)樵诩?xì)胞學(xué)上甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的一系列核特征性改變?cè)阽R下顯示得不夠全面，往往只能觀察辨認(rèn)出3～4條核的特征性改變，不足以直接診斷為“惡性腫瘤”[20]。這也從一方面證明蘇木素單染法在顯示核的特征方面是有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的，有助于減輕細(xì)胞診斷醫(yī)師的閱片視覺(jué)壓力，更容易觀察和辨認(rèn)腫瘤細(xì)胞，因此也有利于做出更準(zhǔn)確的診斷，是值得推薦的一種甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞涂片的染色方法。

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