脂多糖誘導食管鱗狀上皮細胞表達BMP4的研究

張園 彭伯堅 張擁軍 駱鳳嬌

【摘要】 目的：探討脂多糖對食管鱗狀上皮細胞的骨形態(tài)蛋白4（BMP4）表達的影響。方法：體外培養(yǎng)正常食管鱗狀上皮Het-1A細胞，采用不同濃度脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）處理細胞、實時熒光定量PCR與蛋白印跡分析方法測定BMP4及Smad1表達的變化，并對其進行相關性分析。結果：10 ng/mL LPS組可輕微刺激食管鱗狀上皮細胞表達BMP4、Smad1的表達，與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組均明顯增強BMP4和Smad1的表達，且隨濃度增強效應增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：脂多糖可能通過誘導BMP4及BMP信號通路相關蛋白Smad1的表達參與Barrett食管的發(fā)生。

【關鍵詞】 脂多糖； 食管鱗狀上皮細胞； BMP4； Barrett食管

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Lipopolysaccharide on BMP4 expression in esophagus squamous cells.Method：Primary Het-1A cells were treated with Lipopolysaccharide at different concentration.The changes of expressions of BMP4 and Smad1 were examined by real time polymerase chain reaction and Western blot analysis.Result：10 ng/mL LPS group could slightly stimulate the expression of BMP4 and Smad1 in the squamous epithelial cells of the esophagus，there was no significant difference compared with the control group（P>0.05）.The expressions of BMP4 and Smad1 were obviously enhanced in the 100 ng/mL LPS group and the 500 ng/mL LPS group，and the difference was statistically significant with the enhancement of the concentration enhancement effect （P<0.05）.Conclusion：Lipopolysaccharide can regulate the expressions of BMP4 and Smad1，which may play a role in the development of Barrett oesophagus.

【Key words】 Lipopolysaccharide； Esophagus squamous cells； BMP4； Barrett esophagus

First-authors address：Huadu District Peoples Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510800，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.007

Barrett食管（BE）是指食管遠端鱗狀上皮被化生的柱狀上皮取代的病理現(xiàn)象，是公認的食管腺癌（EA）的癌前病變[1]。既往研究認為，BE的病因主要為胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶等反流物對食管上皮細胞慢性損傷的結果，但接近40%的BE患者無GERD癥狀發(fā)生[2-3]。近年來菌群失調在消化系統(tǒng)疾病中的作用得到廣泛重視，相關研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管相比，BE和食管炎末端形成量種截然不同的微生物類型，BE和食管炎末端包含大量微生物革蘭陰性菌（G-）占53.4%，而在正常食管黏膜中多為革蘭陽性菌為代表的厚壁菌門，G-菌只占14.9%。由此筆者推測除胃酸和膽汁刺激外，菌群變化導致炎性因子LPS增高是BE發(fā)生的重要致病因素[4]。在正常成年人的食管黏膜中不表達的BMP4在BE和胃食管反流病的食管鱗狀細胞中表達異常上升[5]，而骨形成蛋白（BMP4）信號傳導通路激活可以誘導鱗狀上皮細胞向腸化柱狀上皮細胞的方向分化，是BE的標志蛋白[6]。筆者推測LPS可激活BMP4信號傳導通路參與BE的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用Real-time PCR、Western blot分別檢測經過不同濃度LPS處理后，正常食管鱗狀上皮Het-1A細胞BMP4、Smad1的表達變化，探討LPS對BMP4及Smad1表達的影響，為深入認識BE的發(fā)生發(fā)展提供新線索，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Het-1A細胞株購自上海序潤生命科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，脂多糖購自sigam公司，實時熒光定量PCR所用的互補DNA第一鏈合成試劑盒購自天根生物科技有限公司，快速SYBR Green Master Mix試劑盒購自美國ABI公司，引物由公司設計合成上海英駿生物技術有限公司，一抗BMP-4、Smad1/5、均購自武漢博士德公司。

1.2 Het-1A食管上皮細胞培養(yǎng) 細胞經消化傳代，以DMEM加15%的胎牛血清作為培養(yǎng)液，于5%CO2的37 ℃溫箱中進行培養(yǎng)，每周換液2～3次，待細胞密度達80%以上進行試驗。

1.3 LPS處理細胞 無血清及添加物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h。應用無血清及添加物的培養(yǎng)基調制LPS濃度分別為10、100、500 ng/mL。應用不同PLS濃度的培養(yǎng)基處理24 h，然后繼續(xù)以無血清及添加物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至24 h。

1.4 實時熒光定量PCR 處理后的細胞提取RNA進行反轉錄和PCR。GAPDH為內參照物，BMP上游引物為5-AGGAAGCAGTCTGTGTAGTGTG-3，下游引物5-GATGTAGTAGAGGGATGTGGG-3；Smad1上游引物為5-CTGCCCTCAGAAATCAACAGAG-3，下游引物5-GTGAAACCATCCACCAACACAC-3；GAPDH上游引物為5-CCCTTCA TTGACCTCAACTACATGG-3，下游引物為5-CATGGTGGTGAAGACGCCAG-3。用2-ΔΔCt值分析各組細胞中BMP4、Smad1相對表達量。每組實驗重復3次。

1.5 蛋白印跡分析（Western blot） Western blot檢測細胞BMP4和Smad1蛋白表達：以GAPDH為內參照物，將細胞裂解液加入至各組細胞中提取總蛋白，將蛋白溶液和上樣緩沖液按2︰1混合均勻，于沸水浴中加熱5 min。于SDS.PAGE系統(tǒng)中進行上樣并電泳分離，轉印至PADF膜上，經封閉、一抗（1︰10 000 Rabbit anti-GAPDH以及1︰1 000 Rabbit anti-BMP4、Smad1）和二抗（1︰5 000羊抗兔IgG/HRP）孵育后，將化學熒光發(fā)光底物均勻地添加至PADF膜的表面，持續(xù)反應5 min。用試劑盒的濾紙除去PADF膜表面多余的底物溶液，放置于暗盒中進行曝光并顯影定影。結果以不同濃度的BMP4、Smad1/5與GAPDH的吸光度比值代表各樣本BMP4、Smad1/5的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 脂多糖對Het-1A中BMP4表達的影響

2.1.1 BMP4 mRNA表達 在培養(yǎng)基濃度100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組中，食管鱗狀上皮細胞的BMP4 mRNA水平分別是對照組的2.20、3.59倍，效應差異存在顯著性（P<0.05）。10 ng/mL LPS組BMP4 mRNA水平與對照組對比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.1.2 BMP4蛋白表達 正常食管鱗狀上皮細胞和低濃度10 ng/mL LPS組無不表達BMP4，100 ng/mL LPS組可促進BMP4的表達，且隨濃度增強效應增強，見表1和圖1。

2.2 脂多糖對Het-1A中Smad1表達的影響

2.2.1 Smad1 mRNA表達 對照組食管鱗狀上皮細胞和10 ng/mL LPS組 Smad1 mRNA均呈低水平表達，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組基因轉錄增強，分別是對照組的1.73、2.56倍，效應差異存在顯著性（P<0.05），見表2。

2.2.2 Smad1蛋白表達 對照組和10 ng/mL LPS組均低表達Smad1，100 ng/mL LPS組可促進BMP4的表達，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2和圖1。

3 討論

近年來，大量研究顯示胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡與人體疾病有著密切的關聯(lián)[7-8]。Gall等[9]發(fā)現(xiàn)在Barrett食管患者中，鏈球菌與普氏菌為其主要菌群，比值越大，Barrett食管發(fā)生風險越高，并且與早期食管腺癌有明顯相關性。脂多糖（LPS），革蘭陰性菌主要的外膜結構，能夠誘導宿主固有免疫反應，通過激活Toll-4受體和NF-κB的途徑上調促炎細胞因子的基因表達誘導炎癥反應[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在反流性食管炎-BE-腺癌的進展過程中，NF-κB的活性逐漸上調，并伴Cdx2的表達水平同時上調[11-12]。此外LPS能夠通過誘導一氧化氮合酶和延遲胃排空的環(huán)氧酶-2的生成使下食管括約肌松弛導致反流性食管炎[13-14]。目前，大多數(shù)觀點認為，食管化生過程與食管長期暴露于胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶等反流物等導致慢性炎癥反應有關[15-16]。但部分患者無反流癥狀，24 h pH檢測無明顯酸反流。因此筆者推測菌群變化LPS表達的升高可能通過誘導炎癥反應導致Barrett食管的發(fā)生，同時可通過松弛下食管括約肌和延遲胃排空促進胃酸、膽汁酸、胃蛋白酶反流促進疾病的演變。

BMP4可誘導細胞凋亡、生長和分化，是上皮-間充質轉化過程的關鍵信號分子。Smads是信號轉導因子，可直接由從細胞膜將BMP4信號轉導入細胞核內[17]。目前BE食管的具體化生過程仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，BMP參與CDX2的調控，通過促CDX2的表達影響B(tài)e的形成[18]。

研究中筆者發(fā)現(xiàn)，正常食管鱗狀上皮細胞并不表達BMP4，10 ng/mL LPS組培養(yǎng)基可輕微刺激BMP4表達，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而100 ng/mL LPS組和500 ng/mL LPS組則明顯增強BMP4表達（P<0.05）。提示，LPS可以促進食管鱗狀上皮細胞BMP4的表達，而且LPS濃度與BMP4表達強度正相關。正常食管鱗狀上皮細胞Smad1表達較低，而LPS可促進 Smad1表達，且LPS濃度與Smad1表達強度正相關。而Smad1表達增強可促進行細胞內的BMP4信號傳遞，并且激發(fā)后續(xù)的信號級聯(lián)放大效應，促進BE的化生[19-20]。

綜上，LPS可通過BMP4和BMP4通路蛋白Smad1表達參與BE的發(fā)生。探索了BE發(fā)生和BMP4在BE上調的可能機制。益生菌的治療可能通過抑制LPS預防BE甚至食管腺癌發(fā)生。但結論仍需進一步研究證實，如LPS影響B(tài)MP4表達的具體分子機制，LPS與酸及膽鹽之間的關系等，由于Barrett食管是多種復合事件共同作用于食管黏膜層面的結果，因此需要綜合更多方面因素進行深層次研究。

參考文獻

[1]楊小平.食管癌及Barrett食管的發(fā)病趨勢、流行病學、內鏡及病理特征分析[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2015.

[2]夏一菊.KLF5在DCA介導下誘導食管鱗狀上皮向柱狀上皮轉分化的作用及機制研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2016.

[3] Sharma N，Ho K Y.Risk factors for Barretts Oesophagus[J].Gastrointest Tumors，2016，3（2）：103-108.

[4]劉寶珠，李曉藝.Barrett食管32例臨床病理分析[J].基層醫(yī)學論壇，2016，20（26）：3700-3701.

[5]崔曼莉，王景杰，張明鑫.微生態(tài)在食管疾病中的意義[J].世界華人消化雜志，2018，26（5）：289-295.

[6]楊浩羿.CDX2、BMP4在Barrett食管及食管腺癌中的表達及意義[D].貴陽：貴陽醫(yī)學院，2015.

[7]閆武.BMP4信號通路與KLF4在Barrett食管形成中的作用研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2016.

[8]戴瓊，顧思嵐，石鼎，等.人體腸道微生態(tài)與疾病發(fā)生發(fā)展的關系及機制研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志，2016，28（5）：614-617.

[9]沈小雪，俞汀，林琳.胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)與胃食管反流病關系的研究進展[J].胃腸病學，2017，22（4）：245-248.

[10] Gall A，F(xiàn)ero J，McCoy C，et al.Bacterial composition of the human upper gastrointestinal tract microbiome is dynamic and associated with genomic instability in a Barretts esophagus cohort[J].PLoS One，2015，10（6）：e0129055.

[11]劉利，解啟蓮，李小雙.亞低溫抑制BV-2細胞脂多糖誘導的Toll樣受體4活化和炎癥因子表達[J].細胞與分子免疫學雜志，2015，31（11）：1479-1482.

[12]王少鑫，靳寶鋒，崔立紅.錨蛋白重復序列通過NF-κB信號通路參與腸炎相關腫瘤的調控[J].世界華人消化雜志，2015，23（2）：189-195.

[13]楊建杰，張玉林.COX2、CDX2在糜爛性食管炎、Barrate食管及食管腺癌中的表達及意義[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14（11）：1621-1623.

[14]郭曉燕，王婷，董蕾，等.一氧化氮合酶在胃食管反流病患者食道黏膜的表達[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2015，36（3）：373-377.

[15]肖蘭.一氧化氮合酶、白細胞介素-8在不同類型胃食管反流病中的表達及意義[J].陜西醫(yī)學雜志，2017，46（6）：778-780.

[16]戴結.EGCG抑制胃食管反流物誘導的人食管上皮細胞NF-κB激活的研究[D].南京：南京大學，2013.

[17]陳志浩，李政奇，王貴齊.食管腺癌發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥的相關性研究[J].中國腫瘤，2017，26（9）：721-726.

[18]吳倩倩，孫琦，黃勤，等.TGF-β/Smads信號轉導通路與胃癌關系的研究進展[J].胃腸病學，2015，20（1）：55-57.

[19]房渝，陳浩，陳曉欣.Barrett食管發(fā)生的分子機制[J].中華消化內鏡雜志，2011，28（8）：428-431.

[20]李萍英.Barrett食管的分子生物學研究進展[J].青海醫(yī)藥雜志，2012，42（3）：93-96.

[21]房殿春.Barrett食管發(fā)生機制的研究進展[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2012，17（2）：89-92.