醒腦開竅針刺法對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織p-Akt（Ser473）表達及細胞凋亡的影響*

韓 林 ，高 旸 ，王旭慧，張亞男 ，張向宇 ，孟麗娜，朱 倩

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193）

缺血性腦血管病在全部腦血管病的發(fā)病率可高達70%[1]，是腦血管病中的最常見類型。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病的重要病理生理機制。腦缺血再灌注可誘導神經(jīng)細胞的凋亡，但其機制仍然不明確，深入探討神經(jīng)細胞的凋亡機制，可為缺血性腦卒中的防治提供新思路。針灸治療中風病療效明確，針灸通過經(jīng)絡、腧穴從多方面、多水平、多途徑產(chǎn)生治療效應，是一種生物信息的傳遞，可引起細胞電生理、細胞生物學的變化。磷脂酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）信號轉(zhuǎn)導通路對細胞增殖、分化、凋亡和糖代謝發(fā)揮重要作用,研究表明PI3K/AKT信號通路的激活，能夠抑制細胞凋亡而發(fā)揮腦保護作用[2]。本研究采用針刺醒腦開竅法主穴內(nèi)關(guān)、人中、三陰交干預腦缺血再灌注模型，通過觀察海馬組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達及細胞凋亡率的變化，探討醒腦開竅針刺法治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠（SPF級）體質(zhì)量（200±20）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物合格證編號：SCXK（京）2016-0011。大鼠于二級動物房喂養(yǎng)，室溫20～25℃，光照時間07:00～19:00，自由攝食、飲水。所有實驗過程均遵循中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑與儀器 Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號：118699000），p-AKT（Ser473）抗體（美國 CST 公司，批號：13），Bax抗體（英國Abcam公司，批號：GR116256-1）、Bcl-2 抗體（英國 Abcam 公司,批號：GR137218－1）。Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司），低溫離心機（德國Eppendorf公司），DYCZ-24KS型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 模型制作 參照ZeaLonga線栓法并加以改進[3]，制作大腦中動脈缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg）。頸部手術(shù)區(qū)域備皮、消毒，取頸部正中稍偏左切口1.5～2 cm，分離皮下筋膜，暴露左側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)，分離左側(cè)頸總動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，于頸總動脈分叉處遠心端和近心端分別用動脈夾夾閉，用1 mL注射器針頭在近心端血管壁穿刺，將直徑0.260 mm的尼龍線栓沿針孔緩慢插入（線栓尖端經(jīng)細砂紙打磨圓頓、光滑），待線栓前段抵達分叉處，放開此處動脈夾，將線栓繼續(xù)送入頸內(nèi)動脈，直至微遇阻力為止，線栓進入顱內(nèi)深度為18～20 mm，插線成功后結(jié)扎頸總動脈，放開另一個動脈夾，分層縫合。阻斷血流2 h后，拔線通過對側(cè)大腦交通動脈實現(xiàn)再灌注。模型成功的標準：動物蘇醒后，按Zausinger 6分法[4]對神經(jīng)功能進行評分，排除評分為0、4、5分及死亡動物，選擇符合標準的大鼠進入下一階段實驗。MCAO造模共用52只大鼠，造模過程中無動物死亡，4只大鼠由于神經(jīng)功能評分不合格被剔除，在后續(xù)實驗中補充剔除動物以保證每組動物數(shù)。本次造模成功率為92.3%。

1.4 動物分組及干預方法 實驗動物按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組26只大鼠。各組隨機分出8只大鼠用于流式細胞檢測，8只大鼠用于Western Blot檢測，5只大鼠用于腦梗死體積檢測,其余5只大鼠用于蘇木精－伊紅（HE）染色。假手術(shù)組僅分離頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍線栓；模型組、電針組采用大腦中動脈閉塞法制備腦缺血再灌注模型；電針組于造模成功后針刺內(nèi)關(guān)、人中、三陰交；假手術(shù)組、模型組大鼠同樣抓取，但不給予針刺治療。

根據(jù)中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，并參考大鼠的解剖結(jié)構(gòu)和體表標志，人中位于鼻尖下1mm唇裂正中，內(nèi)關(guān)位于前肢內(nèi)側(cè)，腕關(guān)節(jié)上約3 mm，尺、橈骨間隙中；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上1 cm。針具選用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長1.5寸，直徑0.30 mm。電針儀選用韓氏神經(jīng)穴位刺激儀HANS－200E（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，產(chǎn)品標準編號為YZB/蘇0049－2008）。先直刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴1 mm至筋間，繼在鼻中隔下部向上斜刺人中穴1 mm，其次直刺患側(cè)三陰交穴3 mm，留針20 min；留針期間將患側(cè)內(nèi)關(guān)穴、三陰交穴針柄分別連接至韓氏神經(jīng)穴位刺激儀，施以疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流1 mA。首次針刺在動物造模成功90 min后進行，每天針刺2次，共3 d。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 神經(jīng)功能評分 神經(jīng)功能評分由專人完成，該人員并未參與手術(shù)造模和電針治療。分別于手術(shù)造模后和治療3日后對所有大鼠神經(jīng)功能進行評分，Zausinger 6分法評定如下[4]：0分不能自發(fā)行走；1分自由走動狀態(tài)下向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分抓住鼠尾，大鼠向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分對于施向病變對側(cè)的側(cè)壓力抵抗力下降者；4分不能伸直病變對側(cè)前爪，甚至全身向?qū)?cè)屈曲；5分無神經(jīng)功能缺損。評分越低，神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.5.2 腦梗死體積檢測 大鼠于治療結(jié)束后斷頭取腦。將腦組織置于－20℃冰箱冷凍15 min，將大腦自大腦半球額極至枕極做連續(xù)冠狀位切片，腦片厚約2 mm，切成6片，放入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液，37℃避光染色15 min。利用Image－Pro Plus 6.0分析軟件計算腦梗死體積，梗死體積（%）＝(對側(cè)半球體積－梗死側(cè)正常體積)/對側(cè)半球體積×100%。

1.5.3 海馬組織HE染色 剝離缺血側(cè)海馬組織，10%福爾馬林固定，經(jīng)梯度乙醇、二甲苯脫水、浸蠟、包埋、切片，蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質(zhì)，再經(jīng)梯度脫水，中性樹膠封片。顯微鏡觀察，圖像采集并分析。

1.5.4 腦細胞凋亡率檢測 大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上快速分離缺血側(cè)海馬組織，液氮研磨，1500r/min離心5 min，棄上清，用PBS制成單細胞懸液，密度為1×106/mL。每個大鼠樣本取100 μL細胞懸液（105個細胞），取 500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。每管加入 5 μL Annex in V－FITC、10 μL 碘化丙啶（PI），輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min。在流式細胞儀上，通過FITC檢測通道檢測Annexin V－FITC（激發(fā)波長488 nm）和通過PE檢測通道檢測PI。以二維點陣圖形式顯示，點的密度代表細胞數(shù)量，縱坐標為PI熒光強度，橫坐標為Annexin VFITC熒光強度，點陣圖顯示為4個象限：1）左下象限AnnexinV－/PI－為正常細胞。2）右下象限 Annexin V+/PI－為早期凋亡細胞。3）右上象限Annexin V+/PI+為中晚期凋亡或死亡細胞。4）左上象限Annexin V－/PI+為機械損傷的細胞。所有數(shù)據(jù)由流式細胞儀自帶的Cell Quest軟件自動處理。

1.5.5 Western Blot蛋白表達檢測 大鼠麻醉后斷頭取腦，于冰上迅速剝離缺血側(cè)海馬組織，將海馬組織分離收集于同一個EP管中，按每20 mg組織加200～400 μL的比例加入裂解液,用手握式電動組織細胞勻漿器在冰上將海馬腦組織制備成勻漿，于冰上靜置20 min后，12 000 r/min，離心10 min收集上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，進行垂直電泳，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白由凝膠中轉(zhuǎn)至PVDF膜，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜、二抗（1∶3 000）37℃孵育 2 h，充分洗膜后，加ECL發(fā)光液1 mL，于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集照片，用凝膠成效系統(tǒng)自帶軟件測定目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的比值作為該樣本蛋白表達水平進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)分析應用SPSS 19.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，正態(tài)分布計量資料治療前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），各個實驗組的兩兩比較采用LSD檢驗，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分 見表1。與本組治療前比較，治療后電針組神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組同期比較，模型組治療前、治療后神經(jīng)功能評分均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，電針組治療后神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別 動物數(shù) 神經(jīng)功能評分治療前 治療后假手術(shù)組 26 5.00±0.00 5.00±0.00模型組 26 2.54±0.58# 2.65±0.56#電針組 26 2.62±0.50 3.27±0.45*△

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)組、模型組、電針組腦梗死體積比例依次為0%、（52.50±12.19）%、（23.46±7.96）%。電針組腦梗死體積比例明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠海馬組織形態(tài)學改變 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞排列整齊，胞質(zhì)均染，結(jié)構(gòu)正常。模型組海馬神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞形態(tài)不完整、腫脹，大量神經(jīng)元丟失、死亡，細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞核溶解、固縮。電針組大鼠海馬區(qū)域細胞紊亂程度減輕，變性、壞死的神經(jīng)細胞明顯減少。

2.4 各組海馬神經(jīng)細胞凋亡率 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)細胞早期凋亡率、總凋亡率均明顯增大（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠海馬神經(jīng)細胞總凋亡率明顯減?。≒＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率比較（±s）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of hippocampalneurons of rats in each group（±s）%

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率比較（±s）Tab.2 Comparison of apoptosis rate of hippocampalneurons of rats in each group（±s）%

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

分組 動物數(shù) 早期凋亡率 晚期凋亡率 總凋亡率假手術(shù)組 8 0.386±0.281 0.113±0.069 0.499±0.337模型組 8 2.311±1.588* 0.441±0.365 2.752±1.866**電針組 8 1.148±1.070 0.231±0.153 1.379±1.161#

2.5 各組海馬組織p－Akt、Bcl－2、Bax蛋白表達 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組p－Akt蛋白表達、Bcl－2/Bax比值明顯減?。≒＜0.05），Bcl－2 蛋白、Bax蛋白表達明顯增大（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，電針組 p－Akt蛋白、Bcl－2 蛋白表達、Bcl－2/Bax比值均明顯增大（P＜0.05，P＜0.01），Bax蛋白表達明顯減小（P＜0.01）。

3 討論

內(nèi)關(guān)、人中、三陰交為醒腦開竅針刺法主穴。多年來由石學敏院士創(chuàng)立的醒腦開竅針法廣泛應用于缺血性腦卒中的臨床治療，臨床效果顯著[5－6]。許多基礎研究也證實醒腦開竅針法可從不同的作用機制方面產(chǎn)生腦保護效應。胡光強等[7]發(fā)現(xiàn)醒腦開竅針刺法可能通過提高缺血再灌注損傷大鼠鼠增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，促進神經(jīng)細胞的增殖和DNA的修復從而改善其神經(jīng)行為功能。孟智宏等[8]發(fā)現(xiàn)大鼠實驗性腦缺血并發(fā)MODS后基礎體溫會降低，醒腦開竅針刺治療可以提高甚至恢復大鼠基礎體溫，從而保護機體。李欽潘等[9]研究證實醒腦開竅針刺法能通過促進腦局灶性缺血再灌注大鼠腦內(nèi)VEGF與GFAP的表達，促進缺血區(qū)大腦皮質(zhì)的血管新生及星形膠質(zhì)細胞活化，有效促進大鼠局灶性腦梗死后的神經(jīng)功能恢復。

表3 各組大鼠海馬組織p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（±s）Tab.3 Expression of p-Akt,Bcl-2 and Bax proteins in hippocampus of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠海馬組織p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達比較（±s）Tab.3 Expression of p-Akt,Bcl-2 and Bax proteins in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Bcl－2/Bax假手術(shù)組 8 0.248±0.051 1.444±0.744模型組 8 0.188±0.057* 0.419±0.065*電針組 8 0.354±0.060**## 1.345±0.203##Bax 0.250±0.147 0.896±0.113**0.452±0.136**##分組 動物數(shù) p－Akt Bcl－2 0.276±0.074 0.372±0.053*0.598±0.165**#

腦缺血發(fā)生后的幾個小時內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以凋亡為主，細胞凋亡可能決定最終梗死體積，因此腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡機制的探索以及基于抗凋亡為靶點的治療成為研究的熱點[10]。細胞凋亡的機制復雜多樣,在眾多細胞凋亡機制涉及的信號轉(zhuǎn)導通路中,磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號轉(zhuǎn)導通路是一條重要的抗凋亡/促增殖信號途徑。Akt是PI3K下游重要的效應介質(zhì)之一，是PI3K/Akt信號通路的中心樞紐和直接靶點，直接傳遞著PI3K的信息[11]。Kroner[12]等研究發(fā)現(xiàn)，Akt活性的最終實現(xiàn)需要Ser473位點的磷酸化，因此很多研究把測定p-Akt（Ser473）的水平作為Akt活化的主要標志。蔡俊等[13]研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能明顯增加大鼠皮層和海馬CA1區(qū)胞核和胞漿Akt和p-Akt(Ser473)蛋白表達水平，改善急性腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷程度。于奎營等[14]發(fā)現(xiàn)腹腔注射堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可明顯增加缺血半暗帶皮層組織p-Akt(Ser473)表達，減少凋亡細胞數(shù)量，改善大鼠神經(jīng)功能。

Akt磷酸化激活后能經(jīng)多種途徑促進細胞存活，既可以促進Bad，caspase-3等凋亡蛋白磷酸化，使其失活，也能夠促進抗凋亡基因如Bcl-2，Bcl-xL等基因的轉(zhuǎn)錄和表達，使細胞存活[15-16]。Bcl-2是細胞凋亡抑制基因，Bax是促細胞凋亡基因。在細胞內(nèi)Bcl-2蛋白和Bax蛋白可相互作用形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，調(diào)控線粒體細胞色素等的釋放，從而構(gòu)成重要的細胞凋亡調(diào)控點之一[17]。Bax過度表達會抑制Bcl-2的作用，而促使細胞凋亡。因而決定細胞凋亡與存活的關(guān)鍵在于Bcl-2與Bax蛋白表達的比例，即Bcl-2/Bax值。吳曉光等[18]發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可能通過降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，進而調(diào)控Bcl-2與Bax蛋白表達比值，起到抑制腦出血神經(jīng)元凋亡、保護腦組織的作用。范茜茜等[19]發(fā)現(xiàn)電針“百會”、“大椎穴”可能通過以通過提升Bcl-2/Bax的比值使抗凋亡基因占據(jù)優(yōu)勢，從而抑制缺血再灌注區(qū)的細胞凋亡，減輕腦水腫，促進神經(jīng)功能恢復。

醒腦開竅針刺法治療腦缺血再灌注損傷療效明確，其腦保護作用涉及多種機制。PI3K/Akt信號通路是否在醒腦開竅針刺法作用機制中發(fā)揮作用，此前未見相關(guān)報道。研究中發(fā)現(xiàn)針刺醒腦開竅針刺法主穴內(nèi)關(guān)、人中、三陰交可明顯提高MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評分（P＜0.01），減小MCAO/R大鼠腦梗死體積（P＜0.01），改善MCAO/R大鼠海馬組織病理損傷，降低海馬神經(jīng)細胞總凋亡率（P＜0.05）；同時針刺內(nèi)關(guān)、人中、三陰交還可以明顯增加海馬組織p-Akt蛋白、Bcl-2蛋白的表達（P＜0.05，P＜0.01），降低 Bax蛋白的表達（P＜0.01），提高 Bcl－2/Bax的比值（P＜0.01）。因此，筆者推測醒腦開竅針刺法可能通過激活PI3K/Akt信號通路，增加p-Akt（Ser473）表達，提高Bcl-2/Bax比值，起到對抗腦缺血再灌注后凋亡發(fā)生的腦保護作用。但目前的研究仍需進一步深入，比如針刺這種物理刺激是如何轉(zhuǎn)化為生物信號影響PI3K/Akt信號通路的，針刺激活PI3K/Akt信號通路的上游作用靶點是什么，是否需要進一步加入通道阻斷劑及激活劑來驗證假說等等，這些工作將成為下一步研究關(guān)注的重點。