肉制品異源基因檢測技術(shù)研究進(jìn)展

胡 謙，陳 穎，倪 凱，葛兆方，曾海娟，王淑娟，馬 蘭，劉 箐,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州 221006）

隨著現(xiàn)代食品產(chǎn)業(yè)的分工越來越細(xì)，鏈條越來越長，食品摻假的問題在各個環(huán)節(jié)都可能出現(xiàn)。2013年的“歐洲馬肉風(fēng)波”波及16 個國家，起因是商家在牛肉中摻入的馬肉中含有對人體有害的苯基丁氮酮（又名“保泰松”）。消費(fèi)者一般直接通過標(biāo)簽了解食品的成分，確定所宣傳的高商業(yè)價值的物種不被其他較低價值物種部分或完全替代非常重要。誤導(dǎo)性標(biāo)簽也可能對健康有負(fù)面影響，特別是沒有說明的潛在過敏原對過敏體質(zhì)的消費(fèi)者危害極大?？偠灾忸悡郊俨坏故称樊a(chǎn)業(yè)朝著不健康的方向發(fā)展，還嚴(yán)重打擊了消費(fèi)者對食品產(chǎn)業(yè)的信心，帶來了經(jīng)濟(jì)損失和對安全問題的擔(dān)憂。

食品識別的初始方法基于形態(tài)特征，例如風(fēng)味、顏色、形狀和味道。在19世紀(jì)，食品檢測方法得到了改善，人們開始使用分析天平和顯微鏡識別外來物質(zhì)[1]。有研究人員開發(fā)了基于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的檢測方法[2-3]，但其存在許多的缺陷，不適用于成分復(fù)雜的食品，而且需要昂貴的儀器和復(fù)雜的統(tǒng)計分析；同時，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)容易在加工處理過程中變性，不能滿足鑒定需要。與上述方法相比，基于DNA的檢測方法優(yōu)點有：1）DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，高溫處理過的食品中仍能提取出小片段的DNA；2）不依賴于組織和細(xì)胞的類型；3）不同的基因進(jìn)化速率不同，可以根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇不同的目的基因；4）DNA比蛋白質(zhì)具有更高的種間多態(tài)性，有利于品種鑒定[4]。目前，用于肉制品檢測的基因一般位于線粒體上。線粒體DNA（mtDNA）具有分子結(jié)構(gòu)簡單[5]、嚴(yán)格的母系遺傳[6]、無組織特異性、無重組[7]、與核基因無共同序列[8]、進(jìn)化速率快[9]、多拷貝[8]及具有分子鐘機(jī)制[10]等優(yōu)點。mtDNA常用的標(biāo)記基因主要有細(xì)胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因、D-loop基因、ND基因、細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（CO I）基因[11]。具有單拷貝特性的核基因可用于肉制品摻假的定量檢測，目前所選擇的單拷貝基因包括DNA復(fù)制蛋白A基因、生長因子β-3基因、白細(xì)胞介素-2前體基因、β-肌動蛋白基因、蘭諾定受體基因、環(huán)狀鳥苷酸磷酸二酯酶基因等。綜上所述，基于形態(tài)特征、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的檢測方法有非常多的局限性，而基于核酸的檢測方法具有適用面廣、特異性強(qiáng)等優(yōu)點。因此，基于核酸分子開發(fā)出簡單、快捷、準(zhǔn)確的肉制品鑒偽技術(shù)將成為未來的趨勢。

1 普通PCR技術(shù)

1.1 常規(guī)PCR技術(shù)

以核酸為基礎(chǔ)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)已經(jīng)成為食品摻假檢測的重要手段之一，并得到了廣泛的應(yīng)用。PCR技術(shù)的突出優(yōu)點是特異性強(qiáng)，由于核酸帶有生物的遺傳信息，針對不同生物設(shè)計物種特異性引物，擴(kuò)增出特定的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增出的DNA片段，以鑒定食品的摻假。徐瑗聰?shù)萚12]已經(jīng)開發(fā)了一種針對食品中豬肉、牛肉、綿羊肉摻假檢測的試劑盒。Karabasanavar等[13]針對位于細(xì)胞核的5-氨基乙酰丙酸合酶基因設(shè)計了一對高度特異性引物，檢測限達(dá)到10 pg，并且驗證該P(yáng)CR技術(shù)適用于60、80、100、121 ℃下加工30 min的雞肉制品，對18 種動物和6 種家禽沒有擴(kuò)增條帶，說明該P(yáng)CR技術(shù)具有高度的特異性。DNA比蛋白質(zhì)和脂質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性，因此PCR技術(shù)可以用于熱加工后肉制品的檢測。

PCR技術(shù)的另一個優(yōu)點是靈敏度高，只要有極少量的摻假行為就可以被檢測出來。但是，高的檢測靈敏度也給PCR技術(shù)帶來了風(fēng)險，肉制品在加工或?qū)嶒灂r受到外界少量污染也會被檢測出來，對實驗造成錯誤判斷。PCR技術(shù)還具有對檢測樣本要求低的特點，因為核酸廣泛存在于動物的細(xì)胞中，而且每個生物個體的核酸具有唯一性，動物不同組織和器官的DNA序列完全相同。PCR技術(shù)的取樣非常廣泛，在動物的肉、毛發(fā)、皮膚甚至是骨頭里都有DNA。但是常規(guī)PCR技術(shù)只能進(jìn)行定性分析，每次只能鑒定一種成分。

1.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR技術(shù)，它是在同一PCR反應(yīng)體系中加上2 對或2 對以上引物，對單一樣本擴(kuò)增多個核酸片段的PCR技術(shù)。其原理、反應(yīng)試劑和操作過程與常規(guī)PCR基本相同。在1988年，Chamberlain等[14]利用多重PCR技術(shù)分析杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因座中的幾個缺失突變，這是多重PCR技術(shù)的首次應(yīng)用。作為一種多靶點檢測技術(shù)，多重PCR受到了研究人員的青睞。何瑋玲等[15]基于4 種肉類線粒體Cyt b基因差異性位點，采用正向引物共用，反向引物特異，設(shè)計了兩套各5 條引物，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時比較了幾種總DNA提取方法的提取效率和純度，確定了兩種比較好的提取總DNA的方法。最終建立快速鑒定4 種肉類的多重PCR方法，相比于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的常規(guī)PCR技術(shù)提高了篩選通量。Dai Zhenyu等[11]基于線粒體CO I基因的高雜合區(qū)設(shè)計7 對物種特異性引物，證明這些引物具有高度物種特異性，對于不同的DNA來源沒有交叉反應(yīng)，并用建立的多重PCR技術(shù)鑒定了當(dāng)?shù)? 種常見的肉類：豬肉、牛肉、雞肉和羊肉。

多重PCR并非簡單地把多個單一的常規(guī)PCR混合，而是要對目的基因進(jìn)行全面的分析，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。選擇的目的基因必須具有高度特異性，根據(jù)選擇的多個目的基因設(shè)計多對引物，擴(kuò)增出的多個片段還應(yīng)具有明顯的長度差異。多重PCR的成功與否取決于在單組PCR條件下引物與其各自靶標(biāo)選擇性退火的能力，因此需要對多個目的基因進(jìn)行復(fù)雜的引物設(shè)計和嚴(yán)格的反應(yīng)條件優(yōu)化。因為優(yōu)化熔融、退火和延伸溫度困難，以及需要防止其形成二級結(jié)構(gòu)和引物二聚體，所以引物設(shè)計是多重PCR系統(tǒng)開發(fā)中最關(guān)鍵的步驟[16]。

2 DNA指紋技術(shù)

2.1 PCR-RAPD技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以隨機(jī)合成大量的10 bp左右寡核苷酸單鏈為引物，提取待測樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。PCR-RAPD技術(shù)在DNA序列未知的情況下，可以直接對物種進(jìn)行分析。然而Fernandez等[17]的研究表明PCR-RAPD技術(shù)是在特異性較低的條件下進(jìn)行的，所以其重復(fù)性差。Rastogi等[18]開發(fā)了一種PCR-RAPD技術(shù)，根據(jù)擴(kuò)增出的條帶數(shù)量、亮度和長度進(jìn)行分析，建立了一種可以鑒別牛、羊、豬、雞等肉品的技術(shù)。Calvo等[19]開發(fā)并評估了一種用于檢測豬肉、雞肉、鴨肉、火雞肉和鵝肉的PCR-RAPD技術(shù)，檢測靈敏度達(dá)到250 pg。

由于2 0世紀(jì)9 0年代基因數(shù)據(jù)庫不夠完善，PCR-RAPD技術(shù)可以作為一種很好的檢測肉類摻假的手段。由于該技術(shù)操作簡單、快速，不依賴基因組遺傳信息，擴(kuò)增片段的多態(tài)性反映了基因組DNA的多態(tài)性，因此在分子檢測中被廣泛使用[20-21]。該技術(shù)的缺點有：重復(fù)性差、只能局限于定性分析；產(chǎn)生大量的擴(kuò)增片段；結(jié)果分析復(fù)雜。但其對于基因序列不了解的物種不失為一種簡便、快捷的分子生物技術(shù)。隨著測序技術(shù)的不斷完善和成本下降，PCR-RAPD可以結(jié)合DNA測序技術(shù)在肉制品檢測中發(fā)揮更大的作用。

2.2 PCR-RFLP技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）的原理是用PCR擴(kuò)增出特異性的DNA片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶消化切割成不同大小的片段，最后直接在瓊脂糖凝膠電泳上分析切割后的片段[22]。不同等位基因的限制性內(nèi)切酶酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。Girish等[23]從樣品中提取DNA，用線粒體12S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用限制性內(nèi)切酶HinfI、Mph1103I、MvaI和Eco47I進(jìn)行限制性分析，然后基于RFLP鑒定肉類。Muhammed等[24]利用PCR-RFLP技術(shù)比較了不同DNA提取方法對生肉、加工肉的提取效率，使用通用引物擴(kuò)增9 個物種的線粒體Cyt b基因的部分序列。結(jié)果表明飽和鹽沉淀法是一種經(jīng)濟(jì)、理想的DNA提取方法，利用PCR-RFLP技術(shù)產(chǎn)生360 bp的Cyt b基因擴(kuò)增子可以有效地檢測生肉和加工肉的摻假。

PCR-RFLP技術(shù)還存在不足之處，比如重復(fù)性差、用限制性內(nèi)切酶酶切時容易受到外界干擾、只適用于單一成分的樣品、多成分混合樣品會干擾實驗結(jié)果等。由于有時切割后的片段長度區(qū)別不大，Layer等[25]設(shè)計末端RFLP方法，使用熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增特定基因，用限制性內(nèi)切酶消化，并通過毛細(xì)管電泳用激光誘導(dǎo)熒光進(jìn)行分析。相比于瓊脂糖凝膠電泳，毛細(xì)管電泳具有更加精準(zhǔn)的DNA片段檢測能力，并且可以容易地區(qū)分相似大小的片段。結(jié)合毛細(xì)管電泳可以大大提高目的DNA檢測的特異性，而且方法簡便、分型時間短、不需要昂貴的儀器，一般的實驗室就可以檢測。

2.3 PCR-AFLP技術(shù)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是Vos等[26]提出的DNA指紋技術(shù)，是PCR-RAPD和PCR-RFLP技術(shù)的巧妙結(jié)合。使用限制性內(nèi)切酶消化總基因組DNA，將雙鏈核苷酸銜接子連接到DNA片段上用作PCR擴(kuò)增的引物結(jié)合位點，設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后在瓊脂糖凝膠上分析DNA片段多態(tài)性[27]。在Vos等提出PCR-AFLP技術(shù)后，研究者迅速用于植物物種基因組的研究，其中大部分用于作物物種和具有重要經(jīng)濟(jì)價值的植物[28-30]。在植物病源真菌方面，該技術(shù)主要涉及作物生產(chǎn)力和抗病性的研究；在細(xì)菌方面涉及菌株和譜系的鑒定，以及系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建。PCR-AFLP技術(shù)在分子生物學(xué)研究中有諸多優(yōu)點，而在動物研究方面，研究者對此技術(shù)持保守態(tài)度。Huang Changwen等[31]利用PCR-AFLP技術(shù)開發(fā)出了鴨的遺傳圖譜。一共產(chǎn)生了296 個多態(tài)標(biāo)記，每個引物對產(chǎn)生7～29 個多態(tài)性標(biāo)記。這表明使用AFLP標(biāo)記的多色熒光檢測是高通量的。Sasazaki等[32]利用PCR-AFLP技術(shù)開發(fā)了一種可以用于日本黑牛和荷斯坦牛檢測的技術(shù)。用500 個引物組合產(chǎn)生了70 000 個條帶，每個引物組合平均有140 個擴(kuò)增片段。其中，約7 000 個是日本黑牛和荷斯坦牛之間的多態(tài)性條帶，僅有6 個符合要求，誤判率僅為1.98%，可以很好地區(qū)分這兩個牛肉品種，有助于檢測牛肉的造假。

PCR-AFLP技術(shù)的優(yōu)點有：高效、快速、穩(wěn)定、可靠、具有廣泛的適用性[33]；可以對成分來源復(fù)雜的樣品進(jìn)行分析；可以產(chǎn)生足夠多的標(biāo)記以滿足多態(tài)性差異小的樣品。然而，在研究中會產(chǎn)生大量的酶切片段，找出特異性的片段往往會耗費(fèi)大量的時間，而如何酶切獲得特異性強(qiáng)的片段至關(guān)重要。

2.4 PCR-SSCP技術(shù)

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）是一種檢測短DNA片段序列之間差異性的非常敏感的技術(shù)。其原理是基于單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率，而遷移率又取決于DNA分子的構(gòu)象，這導(dǎo)致不同序列的DNA不均勻地遷移并呈現(xiàn)出不同的條帶[34]。吳亞君等[35]采用PCR-毛細(xì)管電泳-SSCP技術(shù)建立了梅花鹿產(chǎn)品的快速篩查方法，在線粒體Cyt b基因上設(shè)計出可以擴(kuò)增出梅花鹿、白唇鹿等7 個鹿種樣品的鹿科通用引物，實現(xiàn)了梅花鹿保健品中摻假鹿種成分的大批量快速檢測。Tisza等[36]根據(jù)線粒體12S rRNA基因設(shè)計引物，野雞和火雞樣品產(chǎn)生了277 bp擴(kuò)增子，雞、珍珠雞和鵝樣品產(chǎn)生了278 bp擴(kuò)增子，鴨子和番鴨樣品分別產(chǎn)生了280 bp和281 bp擴(kuò)增子，開發(fā)了PCR-SSCP和PCR-毛細(xì)管電泳-SSCP技術(shù)來鑒定7 種家禽樣品，這兩種方法的重復(fù)性和靈敏度相接近，檢測限達(dá)到了0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）。

SSCP是一種經(jīng)濟(jì)、簡便、快捷的技術(shù)。但影響SSCP穩(wěn)定性的因素很多，實驗過程中須嚴(yán)格控制實驗條件，鑒定時要求同時使用標(biāo)準(zhǔn)品以保證實驗的準(zhǔn)確性。凝膠濃度和丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例會影響SSCP的穩(wěn)定性，在不同的研究中最適濃度不同[37]。恒定的電泳溫度也是SSCP技術(shù)必不可少的，溫度會影響單鏈DNA的分子構(gòu)象，低溫有利于維持單鏈DNA分子構(gòu)象的穩(wěn)定性，而高溫會破壞DNA的構(gòu)象[38]。如果嚴(yán)格優(yōu)化實驗條件，可以鑒別DNA分子的堿基缺失、插入和突變，PCR-SSCP技術(shù)完全可以作為檢測肉制品摻假分辨率極高的一種技術(shù)。

3 qPCR技術(shù)

實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)于1993年首先由Higuchi等[39]提出，從此，PCR技術(shù)實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。傳統(tǒng)PCR技術(shù)只能對最后擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行檢測，而qPCR技術(shù)可以監(jiān)測整個PCR擴(kuò)增的過程。qPCR技術(shù)的原理是在PCR體系中加入特異性寡核苷酸探針或非特異性DNA熒光染料，在DNA擴(kuò)增過程中監(jiān)測熒光信號，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量分析[40-41]。

加入特異性寡核苷酸探針是為了利用探針與目的片段特異性雜交產(chǎn)生的熒光信號，來監(jiān)測PCR擴(kuò)增。信號產(chǎn)生基于熒光共振能量遷移原理，即當(dāng)供體分子的熒光光譜與受體分子激發(fā)光譜重疊，供體分子自身熒光強(qiáng)度衰減，受體分子熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，典型的是TaqMan探針[21]。Chisholm等[42]對雉雞和鵪鶉的Cyt b基因設(shè)計了引物和探針，并且優(yōu)化以實現(xiàn)物種特異性鑒定。K?ppel等[43]用多重qPCR確定牛肉、豬肉、雞肉和火雞肉的比例，稀釋4 個物種的DNA來研究靈敏度。應(yīng)用這種4重qPCR系統(tǒng)將能夠有效地鑒定肉類產(chǎn)品的組成。吳亞君等[44]以馬和驢線粒體tRNA-Thr及D-loop區(qū)為靶序列，設(shè)計合成特異性引物和探針，建立了阿膠中馬和驢成分高特異、高靈敏度的qPCR檢測方法。

目前研究較為普遍的熒光染料有SYBR Green、SYTO和EvaGreen，2011年Eischeid[45]在研究中比較了3 種染料對PCR的影響。使用熒光染料具有適用性廣、實驗成本低的特點。在DNA模板不斷變化的情況下，基于染料的檢測方法可以有效防止特異性探針結(jié)合區(qū)域堿基對錯配導(dǎo)致的假陽性。大多數(shù)qPCR使用的熒光染料是SYBR Green，其具有非常高的信號，但是其會抑制PCR，并且相較于其他化學(xué)物質(zhì)檢測范圍有限[46]。所以SYBR Green必須以低濃度使用，從而避免在熔融期間染料再分布對實驗造成影響。有研究表明SYTO染料（一種花青染料）最有潛力替代SYBR Green應(yīng)用于qPCR[45]。SYTO染料與DNA之間的作用非常復(fù)雜，受到靜電力、范德華力、疏水作用和空間作用的影響。EvaGreen是另一種DNA染料，已經(jīng)作為SYBR Green的替代品銷售。EvaGreen比SYBR Green使用濃度更高，能產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號，同時靈敏度更高、穩(wěn)定性更強(qiáng)，并且不對PCR有抑制作用。Meira等[47]利用EvaGreen染料，基于線粒體Cyt b基因設(shè)計新的特異性引物，開發(fā)了對食品中馬肉定性和定量檢測技術(shù)，檢測限達(dá)0.000 1%。Amaral等[48]基于18S rRNA基因開發(fā)和驗證了一種加工肉制品中豬肉定量的EvaGreen qPCR技術(shù)，可以對原料和熱處理的肉類進(jìn)行檢測和定量分析，檢測限和定量限分別高達(dá)0.000 1%和0.01%。K?ppel等[49]開發(fā)了一種定量多重qPCR方法，可以用于確定火雞、雞、鴨、鵝和豬肉樣品的DNA和肉類部分比例，對于主要組分測量不確定度為39%；對于次要組成部分，不準(zhǔn)確度約為124%。盡管測量不確定度很高，但其還是可以用于檢測肉制品的摻假。You Jia等[50]開發(fā)了一種區(qū)分鹿和其他家畜的多重qPCR技術(shù)，可以測試常見的鹿制品，包括鹿肉、鹿血、鹿茸，經(jīng)檢測這種用于鑒定鹿和其他家畜的高通量qPCR技術(shù)是特異性的、敏感的和可靠的。

表 1 目前TaqMan qPCR技術(shù)在肉制品行業(yè)的國標(biāo)和行標(biāo)Table 1 Current national standard and industry standards on TaqMan qPCR for the detection of meat products

qPCR技術(shù)基于Ct值進(jìn)行定量分析，Ct值是指反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值時的循環(huán)數(shù)。qPCR體系的Ct值與起始拷貝數(shù)的對數(shù)具有線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越大，達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)就越小，即Ct值就越小[51]，所以說這種定量是相對定量。另外，qPCR技術(shù)可以和多重PCR技術(shù)結(jié)合，在一個qPCR體系中加入多對引物，提高了檢測通量。今后單拷貝的核基因?qū)⒆鳛閝PCR的主要研究對象，這是因為線粒體基因具有多拷貝的特點，在定量檢測中會造成較大誤差。Cheng Xin等[52]針對核基因（豬的β-肌動蛋白基因、雞的轉(zhuǎn)化生長因子基因、鴨的T細(xì)胞生長因子基因）設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針，建立了一種多重TaqMan qPCR技術(shù)，同時對血凝塊樣品中豬、雞和鴨成分進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)。TaqMan qPCR技術(shù)在我國已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肉制品真?zhèn)螜z測，表1是我國肉的定性檢測國標(biāo)和行標(biāo)。目前肉制品檢測標(biāo)準(zhǔn)還主要集中于定性檢測，為了鑒定摻假程度、區(qū)別外界污染和人為摻假，定量檢測還有待研究。隨著肉制品摻假的復(fù)雜化，為了更快速地檢測多個不同成分，開發(fā)高通量的檢測技術(shù)也將成為未來的研究重點。

4 ddPCR技術(shù)

第一代PCR技術(shù)通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行終點分析以獲得定性結(jié)果。qPCR技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著第二代PCR技術(shù)的誕生，其通過使用熒光染料或特異性探針監(jiān)測擴(kuò)增的進(jìn)展來實現(xiàn)定量。在qPCR中，通過Ct值來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量信息，需要外部校準(zhǔn)物或內(nèi)源對照的標(biāo)準(zhǔn)化以估計未知物的濃度，這反過來限制了該技術(shù)定量的準(zhǔn)確性。逐漸有人意識到，PCR終點和泊松分布的組合可以對核酸濃度進(jìn)行絕對定量，這種方法被稱為數(shù)字PCR（digital-PCR，dPCR）技術(shù)。目前dPCR技術(shù)分為微滴式數(shù)字PCR（droplet digital-PCR，ddPCR）技術(shù)和芯片式數(shù)字PCR（chip digital-PCR，cdPCR）技術(shù)，由于肉制品摻假檢驗主要用的是ddPCR技術(shù)，所以這里主要討論ddPCR技術(shù)。在ddPCR中，利用微滴技術(shù)把整個體系均勻地分配到大量的微滴中，每個微滴中含有一個到多個或不含目的DNA模板，每個微滴中單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后逐個對微滴檢測熒光信號，最后根據(jù)熒光微滴的個數(shù)和泊松分布來進(jìn)行絕對定量[53]。Scollo等[54]在實驗中比較了qPCR和ddPCR技術(shù)的檢測濃度和分辨率，結(jié)果顯示ddPCR技術(shù)具有更好的分辨率和較低的極限稀釋值。ddPCR線性回歸分析顯示其準(zhǔn)確性與qPCR相近，ddPCR檢測的是大量單個的微滴，從而進(jìn)行定量分析，可以區(qū)分少量的外界污染和刻意的造假。但應(yīng)特別注意避免抑制DNA聚合酶擴(kuò)增的污染物產(chǎn)生的假陰性結(jié)果。

ddPCR技術(shù)是對目的DNA的絕對定量，不借用標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以目的DNA的選擇至關(guān)重要。mtDNA具有多拷貝的特點，這使得ddPCR利用mtDNA來定量存在很大的偏差。為了克服這個問題，開發(fā)針對單拷貝的基因是ddPCR技術(shù)的關(guān)鍵。任君安等[55]以羊和豬的單拷貝核基因DNA復(fù)制蛋白A1（replication protein A1，RPA1）為靶基因，設(shè)計了特異性引物和探針，通過理論推導(dǎo)驗證了兩種肉基因拷貝數(shù)之比的固定值，根據(jù)此將羊肉和豬肉的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而絕對定量羊肉和豬肉的比例，豬肉的檢測限達(dá)到1%。Floren等[56]開發(fā)了一種ddPCR測定靶向核F2基因，對牛肉、馬肉和豬肉在加工肉制品中精確量化的方法。運(yùn)用該方法對14 個不同的物種進(jìn)行了特異性驗證，結(jié)果顯示定量限和檢測限分別為0.01%和0.001%。表2總結(jié)了國內(nèi)外關(guān)于ddPCR技術(shù)在肉制品摻假定量檢測方面的研究現(xiàn)狀。

表 2 國內(nèi)外ddPCR定量技術(shù)研究進(jìn)展Table 2 Recent progress of ddPCR in China and abroad

5 DNA條形碼技術(shù)

當(dāng)前基于PCR技術(shù)檢測摻假缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和普遍性。2003年，Hebert等[62]開發(fā)出了一種新的DNA檢測技術(shù)——DNA條形碼技術(shù)。該技術(shù)讓DNA檢測技術(shù)從樣品收集到結(jié)果分析程序標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)分析計算機(jī)化。利用生物體內(nèi)一段幾百個堿基的DNA序列作為條形碼進(jìn)行物種鑒定，就像超市中使用的條形碼一樣。理想的DNA條形碼技術(shù)需要具有兩個基本特征：高分類學(xué)覆蓋率，也稱普遍性，是指在廣泛的物種中具有DNA條形碼檢測的靶片段；高分辨率確保DNA條形碼序列具有高的種間多態(tài)性和低的種內(nèi)變異性。

目前，常用線粒體CO I基因的部分片段，一般以500～700 個堿基序列作為動物的條形碼區(qū)域，原因是其編碼的氨基酸序列受到了嚴(yán)格的限制，可以使用通用引物。此外，缺乏內(nèi)含子、多拷貝、嚴(yán)格的母系遺傳使線粒體基因組成為良好的條形碼候選者。為管理全球條形碼數(shù)據(jù)推出的生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（http://www.barcodinglife.org）已經(jīng)公布了550多萬條動物DNA條形碼，同時創(chuàng)建了3 個全球性節(jié)點——中央節(jié)點、區(qū)域節(jié)點和國家節(jié)點。高玉時等[63]基于線粒體CO I基因，以13 個中國地方雞種和2 個國外引進(jìn)品種作為研究對象，發(fā)現(xiàn)15 個雞種的DNA分類學(xué)和形態(tài)學(xué)分類基本一致，建立的DNA條形碼技術(shù)可以有效地識別不同雞種。Nagalakshmi等[64]從印度不同的地理位置收集了100 種海鮮樣品，包括新鮮、冷凍、即食和罐裝產(chǎn)品，將CO I基因序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，對樣品進(jìn)行鑒定。

DNA條形碼技術(shù)的檢測范圍更廣，結(jié)果也更加精確。如果將來給每個物種一個條形碼將大大加快物種鑒定的速度。海洋物種極為豐富，從形態(tài)上難以區(qū)分。迄今為止，對一些生物群體（例如魚類）的研究很多，但仍然需要大量的工作來對未被研究的群體提供可靠的DNA條形碼數(shù)據(jù)。

6 結(jié) 語

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對肉制品的需求量越來越大。商家為了追求利益，往往會在肉制品中摻入一些廉價肉或者未經(jīng)檢驗檢疫的肉。以上方法是近些年來基于核酸檢測的主要方法。形態(tài)學(xué)和基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)在肉制品摻假、摻雜檢測中有非常大的局限性，基于核酸的檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，且核酸比蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的熱穩(wěn)定性強(qiáng)。所以，基于核酸的檢測方法逐漸成為國內(nèi)外肉制品摻假檢測的研究熱點。

常規(guī)PCR技術(shù)對檢測樣品要求低，動物組織細(xì)胞中均含有核酸，微量的異源DNA都可以檢測出來。但是常規(guī)PCR只能做定性檢測，不能區(qū)分異源DNA是故意摻假還是污染導(dǎo)致。多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR技術(shù)之上，通過對一個反應(yīng)體系設(shè)計多對引物，可以增加多重PCR檢測通量，但是多重PCR技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)一樣不能定量分析，從而不能區(qū)分污染。DNA指紋技術(shù)建立在DNA序列多態(tài)性的基礎(chǔ)上，發(fā)展出眾多技術(shù)：RAPD、RFLP、AFLP、SSCP。DNA指紋技術(shù)具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點。

早期肉制品檢測主要集中在定性檢測方面，然而隨著摻假形式的多變，為了提高檢測的可信度，對肉制品中成分定量分析成為必然趨勢。qPCR技術(shù)為肉制品檢測提供了新的途徑，該技術(shù)可以監(jiān)測整個反應(yīng)過程。目前該技術(shù)同樣存在一些缺陷：如定量依賴于Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線；特異性探針價格昂貴；需要開發(fā)對PCR擴(kuò)增沒有抑制的熒光染料；選擇合適的單拷貝目的基因設(shè)計引物困難；對檢測機(jī)構(gòu)的設(shè)備要求較高；單次檢測成本較高；國內(nèi)定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，還局限于定性檢測；容易受到非目的基因和雜質(zhì)的干擾。ddPCR技術(shù)作為第3代PCR技術(shù)，可以對樣品中的DNA絕對定量，不需借用標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是ddPCR技術(shù)的檢測通量低；靈敏度還有待提升；對實驗人員的操作要求更高；目前還沒有建立任何的標(biāo)準(zhǔn)。相信隨著技術(shù)的不斷完善，qPCR技術(shù)和ddPCR技術(shù)將在定量檢測領(lǐng)域發(fā)揮更好的作用。mtDNA在不同生物、不同組織和細(xì)胞中具有多拷貝的特點被廣泛應(yīng)用于肉制品檢測，但是這也導(dǎo)致mtDNA不適合于定量分析。在摻假肉制品的定量分析中，重要的是找到單拷貝合適的內(nèi)源基因作為定量分析的依據(jù)。DNA條形碼技術(shù)是對擴(kuò)增出的DNA片段測序，然后與已知物種的DNA進(jìn)行比對，這種技術(shù)相對于其他技術(shù)準(zhǔn)確性最高。但是仍然需要大量的工作以完善DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，而種間差異性低的物種不適用于DNA條形碼技術(shù)。

我國于2011年頒布GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》，預(yù)包裝食品的標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)示配料表，規(guī)定按制造或加工食品時加入量的遞減順序排序，加入量不超過2%的配料除外。法規(guī)的實施還需要建立完善的檢測標(biāo)準(zhǔn)，這就要求科研人員針對不同物種開發(fā)重復(fù)性高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)。