殼寡糖通便功能的研究

梁宇軒，歐陽冬梅，王達，陳詠春，劉煥，賀永健，莊新棟，黃日明，孫遠明，王弘

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東省食品質量與安全重點實驗室，廣東廣州510642）

便秘（constipation）是一種由腸道癥狀定義的綜合征，表現(xiàn)為排便次數(shù)減少和（或）排便困難、糞便干硬、排便不盡感[1]。據(jù)流行病學調查顯示，我國成人慢性便秘的患病率為4%～6%[2-4]，且患病率隨年齡增長而升高，60歲以上人群慢性便秘患病率高達22%[5]。便秘不但給患者帶來直接的痛苦，而且還可能誘發(fā)心腦血管疾病，增加大腸癌患病率[6-7]，導致抑郁或焦慮等，嚴重影響患者的生活質量[8]，并給社會經(jīng)濟造成巨大負擔[9]。

目前便秘常用的防治方法是藥物治療和飲食調節(jié)[10-15]。藥物治療常使用滲透性瀉劑[16-17]、刺激性瀉劑[18-19]、促分泌劑[20]和促動力劑[21]等，效果多數(shù)雖較明顯，但有一定副作用。飲食調節(jié)近年來成為研究熱點，有較多關于補充低聚糖[11-12]、膳食纖維[13-14]和益生菌[15]對通便作用的研究報道，但不同種類的低聚糖、膳食纖維通便的作用均有差異。殼寡糖（chitooligosaccharide，COS）是 2-氨基-2 脫氧-β-D-葡萄糖通過 β-1，4糖苷鍵連接的呈堿性的水溶性低聚糖[22]，分子量范圍在322 Da～1 610 Da。2014年，衛(wèi)計委第六號公告正式批準殼寡糖為新食品原料。關于COS通便作用鮮見研究報道。因此，以昆明小鼠為對象，開展本研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖：山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司，含量84%，相對分子質量為322 Da～1 610 Da；鹽酸洛哌丁胺：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹膠：分析純，成都市科龍化工試劑廠；活性炭粉：分析純，天津市福晨化學試劑；101-1型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器儀表有限公司；JJ1000型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；BS-110S天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 動物

昆明種小白鼠SPF級（雄性，初始體重為18 g～22 g），由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0002，小鼠飼養(yǎng)于華南農業(yè)大學實驗動物中心，室溫（25±2）℃，相對濕度（55±5）%，自由獲取食物和飲水，實驗動物使用許可證號SYXK（粵）2014-0136，屏障環(huán)境由華南農業(yè)大學實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范（2003版）》中“通便功能檢驗方法”[23]設計小腸運動實驗和排便實驗，并在此基礎上測定糞便含水量。

1.3.1 劑量設計與分組

在小腸運動實驗中，50只小鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周

1.3.4 排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量測定

受試物灌胃方式同1.3.3。7 d后各組小鼠禁食不禁水16 h，模型對照組和3個劑量組分別給予鹽酸洛哌丁胺（10 mg/kg·BW），空白對照組給予蒸餾水，30 min后，COS 3個劑量組分別給予含相應COS濃度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白對照組和模型對照給墨汁灌胃后，每只小鼠均單籠飼養(yǎng)，正常飲食進水。從給予墨汁開始計時，觀察記錄每只小鼠排出首粒黑便時間、6 h內黑便粒數(shù)及重量。

1.3.5 糞便含水量的測定

收集1.3.4方法中6 h內的新鮮糞便，立即稱量，隨后105℃烘干至恒重，稱量其干重。計算糞便含水量[24]。計算如式（2）：后，按體重隨機分組，每組10只。依據(jù)殼寡糖的人體推薦最大攝入量（0.5 g/d，人體體重以60 kg計），分別以人體最大推薦劑量的10、20、40倍設置小鼠的低、中、高劑量組，即劑量分別為99.2、198.4、396.8 mg/（kg·d）?？瞻讓φ战M和模型對照組均給予蒸餾水。排便實驗小鼠只數(shù)與分組方式同前。

1.3.2 試劑的配置

墨汁的配置：準確稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性碳粉50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容到1 000 mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

鹽酸洛哌丁胺懸濁液的配置：臨用前，根據(jù)小鼠體重和灌胃劑量（0.3 mL），配置鹽酸洛哌丁胺懸濁液。在小腸運動實驗中，鹽酸洛哌丁胺給予劑量為5 mg/kg·BW，在排便實驗中，鹽酸洛哌丁胺給予劑量為 10 mg/kg·BW。

1.3.3 小腸運動實驗

每日定時經(jīng)口灌胃一次，灌胃體積為0.3 mL。劑量組給予不同濃度的COS，空白對照組和模型對照組均給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃7 d。7 d后各組小鼠禁食不禁水16 h，模型對照組和COS 3個劑量組給予鹽酸洛哌丁胺（5 mg/kg·BW），空白對照組給予蒸餾水。30 min后，COS 3個劑量組分別給予含相應COS濃度的墨汁（含5%活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白對照組和模型對照組給予墨汁灌胃。25 min后頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至盲腸部的整段小腸，不加牽引平鋪呈直線。測量小腸全長和幽門至墨汁運動前沿，計算小腸墨汁推進率，如式（1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定

采用SPSS Statistics 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。小腸墨汁推進率需進行數(shù)據(jù)轉換，轉換公式如式（3）。需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，若方差齊時，采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗；若方差不齊，則進行適當?shù)淖兞哭D換，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計分析[23]。

式中：p為小腸墨汁推進率，轉換值X用小數(shù)表示。

6 h內黑便粒數(shù)或6 h內黑便重量任一項結果陽性，同時小腸運動實驗和首粒排黑便時間任一項結果陽性，可判定該項實驗結果陽性[23]。

2 結果與分析

2.1 殼寡糖對小鼠體重的影響

進行小腸運動實驗和排便實驗時各組小鼠初始體重一致（見表1、表2）。給予相應受試物7 d后，空白對照組、模型對照組及3個劑量組小鼠最終體重均無顯著性差異，表明COS對小鼠的正常生長發(fā)育無不良影響。

表1 小腸墨汁推進實驗中殼寡糖對小鼠體重的影響Table 1 The effect of COS on the weight of mice in intestinal movement experiment

表2 排便實驗中COS對小鼠體重的影響Table 2 The effect of COS on the weight of mice in defecating experiment

2.2 殼寡糖對小鼠小腸運動的影響

殼寡糖對小鼠小腸運動的影響見表3。

表3 COS對小鼠小腸運動的影響Table 3 The effect of COS on intestinal movement of mice

在小腸運動實驗中，模型對照組與空白對照組比，小腸墨汁推進率顯著降低（p<0.01），表明給予鹽酸洛哌丁胺后，小鼠小腸蠕動抑制模型建立成功。與模型對照組比，各劑量組小腸墨汁推進率均有一定程度增加，其中，COS中劑量組小腸墨汁推進率（51.96±9.95）%顯著增加（p<0.05），COS高劑量組小腸墨汁推進率（60.48±13.60）%極顯著增加（p<0.01）。

表4 COS對小鼠排便的影響Table 4 The effect of COS on defecating of mice

2.3 殼寡糖對小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的影響

殼寡糖對小鼠排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的影響見表4。

在排便試驗中，模型對照組小鼠首粒排黑便時間極顯著長于空白對照組（p<0.01），而6 h黑便粒數(shù)和重量均極顯著小于空白對照組（p<0.01），說明小鼠便秘模型成立。在首粒排黑便時間上，與模型對照組（342.4±33.6）min比，COS各劑量組小鼠的首粒排黑便時間均有一定程度的縮短，并呈劑量依賴關系，其中高劑量組（157.2±56.4）min首粒排黑便時間極顯著縮短（p＜0.01）；在小鼠6 h黑便粒數(shù)和黑便重量上，隨著COS劑量增加而增加，其中COS高劑量組6 h黑便粒數(shù)（7.8±3.7）粒相對模型對照組（1.9±2.0）粒顯著增加（p＜0.05）。在小鼠6 h黑便重量上，中劑量組小鼠（134±63）mg和高劑量組小鼠（145±80）mg相對模型對照組小鼠（33±43）mg均顯著增加（p＜0.05）。

表5 COS對小鼠糞便含水量的影響Table 5 Effect of COS on stool moisture content

表6 COS和其他低聚糖對小鼠通便的作用Table 6 The laxative effect of COS and the other oligosaccharides on mice

2.4 殼寡糖對小鼠糞便含水量的影響

殼寡糖對小鼠糞便含水量的影響見表5。

由表5可知，模型對照組和空白對照組與COS各劑量組小鼠的糞便含水量間無顯著差異，表明COS各劑量組并未增加小鼠糞便持水。

2.5 COS和其他低聚糖對小鼠通便的作用

COS和其他低聚糖對小鼠通便的作用見表6。

本實驗結果與其他低聚糖通便功能研究結果[25-28]相比，其有效劑量相對較低，表明COS具有通便潛在的優(yōu)勢（表6）。如小腸墨汁推進率指標，本實驗COS中劑量組[198.4 mg/（kg·d）]呈現(xiàn)顯效（p<0.05），而低聚果糖[25]、低聚果糖[26]、皇帝蕉低聚糖[28]、粉蕉低聚糖[28]分別為9.90、2.50、1.25、1.25 g/（kg·d）時才達到顯效（p<0.05或p<0.01），有效劑量約相差6倍到49倍；首粒黑便時間（min）、6 h黑便粒數(shù)、6 h黑便重量（mg）等指標也呈現(xiàn)類似趨勢。

3 討論

結果表明：與模型對照組比，COS中劑量組[198.4 mg/（kg·d）]顯著增加小鼠小腸墨汁推進率和6 h黑便重量（p<0.05）；COS高劑量組[396.8 mg/（kg·d）]極顯著增加小鼠小腸墨汁推進率（p<0.01）、極顯著縮短首粒排黑便時間（p<0.01）、顯著增加6 h黑便重量和6 h黑便粒數(shù)（p<0.05）。根據(jù)衛(wèi)生部“通便功能檢驗方法”[23]判定標準，當小腸運動實驗和排便時間任一項結果陽性，同時6 h黑便粒數(shù)和6 h黑便重量任一結果陽性，可判定COS對小鼠有通便作用。在COS中劑量下，小腸墨汁推進率和6 h黑便質量均顯著增加（p<0.05），可判定COS對小鼠有通便作用，COS高劑量組4項結果均為陽性，通便作用更佳。

關于低聚糖通便可能有兩條途徑，一是通過增加糞便含水量，軟化糞便、增大體積，從而改善便秘[29-32]；二是調節(jié)腸道菌群，促進微生物發(fā)酵，從而加速腸道傳輸[32-36]；或者二者兼有。本實驗中，各劑量組、模型對照組及空白對照組之間，糞便含水量無顯著性差異，表明COS不是通過第一條途徑起作用的，推測可能是通過第二條途徑起作用，即COS調節(jié)腸道菌群，促進微生物發(fā)酵，酵解產(chǎn)物（特別是短鏈脂肪酸）產(chǎn)生滲透作用，從而加速腸道傳輸，通便。