豆豉中產(chǎn)甲基萘醌菌株分離、篩選及其鑒定

杜霞，陳衛(wèi)平，袁干軍，鄺丙娣

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

甲基萘醌（menaquinone，MK），又稱為維生素 K2，由甲基萘醌母環(huán)和3號(hào)位上異戊二烯側(cè)鏈組成，為一類2-甲基-1，4-萘醌同系物的總稱[1]。根據(jù)其側(cè)鏈異戊二烯結(jié)構(gòu)數(shù)目不同，可分為14種，用MK-n表示（如圖1）。MK最早由丹麥化學(xué)家Henfik Dam在研究膽固醇代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)[2]，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，對(duì)光和堿敏感，易被氧化，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑[3]。MK作為人體所必須的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素之一，具有重要生理活性。MK為將谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為γ羥基谷氨酸的羥化酶合成的重要輔助因子，與Ca+鰲合以促進(jìn)血液凝固[4]。同時(shí)有效預(yù)防骨質(zhì)疏松功效[5-6]。MK能降低外界對(duì)大腦新型膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，可用于治療心血管疾病[7]，癌癥[8]，帕金森[9]等疾病。目前MK生產(chǎn)方式主要為化學(xué)合成，此方法具有成本高，產(chǎn)物產(chǎn)量低，反應(yīng)條件嚴(yán)格等劣勢(shì)，相對(duì)而言，微生物生產(chǎn)以產(chǎn)量高，成本低，反應(yīng)溫和，副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)吸引眾多研究者的目光[10]。

自然界中許多芽孢桿菌呼吸過(guò)程能產(chǎn)生甲基萘醌[11]，如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[12]，納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）[13-14]，黃桿菌（Flavobacterium sp.）[15]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[16]，遲緩芽孢桿菌（Bacillus lentus）[17]，蘇云金臘樣芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）[18]等，其中尤其是納豆芽孢桿菌MK產(chǎn)量較高，得到國(guó)內(nèi)外的廣泛注意和研究[19]。豆類食品中富含維生素K2，并且適宜各種芽孢桿菌生長(zhǎng)。據(jù)此學(xué)者們從各種豆類食品中篩選出產(chǎn)MK菌株，如日本納豆[17-18]，云南香草豆[20]，韓國(guó)清曲豆醬[21]等。在我國(guó)，豆豉是一種以豆類為原料發(fā)酵生產(chǎn)的傳統(tǒng)食品，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[22]。本研究以江西特產(chǎn)發(fā)酵型豆豉為原材料，利用耐熱性分離芽孢桿菌。菌株發(fā)酵液經(jīng)離心，冷凍干燥，萃取純化處理后，進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）檢測(cè)，篩選得到目標(biāo)菌株并鑒定。為MK微生物生產(chǎn)提供一株優(yōu)良菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，此篩選方案切實(shí)可行，為產(chǎn)MK菌株篩選提供了可行性方法。

圖1 MK-n化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of MK-n

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來(lái)源：江西產(chǎn)發(fā)酵型豆豉。

1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl0.5g，瓊脂1.5 g，水100 mL，pH 7.4。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，蛋白胨 1.5 g，KH2PO40.1 g，K2HPO4·3H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油0.5 g，豆粉 4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.3 g，水 100 mL，pH7.0～7.2。

1.3 試劑

MK-7標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.8%）：美國(guó)ChromaDex公司；異丙醇、甲醇（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；氯仿、四氫呋喃、戊二醛、乙醇（分析純）：上海國(guó)藥試劑公司。

1.4 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3751L）：日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；高效液相色譜儀（Waters e2695）、檢測(cè)器（2998ePDA）、C18色譜柱高效色譜柱（460 mm×250 mm，5 μm）：美國(guó) Waters公司；DNA 抽提試劑盒：生物工程（上海）股份有限公司；PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)（GL-21M）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（XINYI-IID）：寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-10-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（JSM-6701F）：日本電子株式會(huì)社；飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（AB Sciex 5600）：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 芽孢桿菌篩選

無(wú)菌條件下稱取5 g豆豉，于50 mL無(wú)菌生理鹽水，80℃水浴30 min。震蕩混勻，取1 mL菌液于9 mL生理鹽水，稀釋至適宜濃度。采用涂布平板法，分離出單菌落。對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和光學(xué)顯微鏡觀察菌落特征，選擇革蘭氏染色陽(yáng)性桿狀菌株，即芽孢桿菌，保存以備下一步試驗(yàn)。

1.5.2 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

取初篩菌株，接兩環(huán)于250 mL三角瓶中，裝瓶量為100 mL種子培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化，條件為：37℃，110 r/min，培養(yǎng)24 h。按照3%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃，110 r/min條件下培養(yǎng)3 d。

1.5.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析

發(fā)酵液處理：發(fā)酵液在4℃，6 000 r/min高速離心15 min，重復(fù)3遍，收集下層沉淀菌體。置于-80℃冰箱8 h，真空冷凍干燥1.5 d，得到干燥菌體。按照有機(jī)溶液∶菌體體積比為35∶1加入，有機(jī)溶劑為甲醇與異丙醇等量混合，細(xì)胞破碎處理（超聲2 s，間隙3 s）12 min，減壓抽濾，收集萃取液。在25℃條件旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮樣品。

產(chǎn)物分析：將濃縮樣品溶解于上機(jī)液（異丙醇∶四氫呋喃體積比為9∶1）中，準(zhǔn)確定容至2 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜。HPLC檢測(cè)分析。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步分析，與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，確定是否含有MK-7。利用峰面積定量分析，篩選得到產(chǎn)量較高菌株。

HPLC色譜條件：流動(dòng)相甲醇∶異丁醇體積比為4∶1，流速1 mL/min，柱溫40℃。檢測(cè)器PDA（光電二極管矩陣檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm），進(jìn)樣量為20 μL。

1.5.4 產(chǎn)物液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）驗(yàn)證

發(fā)酵液提取樣品經(jīng)HPLC分離，質(zhì)譜掃描檢測(cè)，驗(yàn)證菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物中MK產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)物制備：通過(guò)高效液相色譜柱分離，根據(jù)產(chǎn)物出峰時(shí)間在高效液相色譜儀檢測(cè)器后的出口收集樣品約500 mL。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再溶解于異丙醇中，定容至2 mL，以備LC-MS檢測(cè)。

LC-MS質(zhì)譜條件：加速電壓15 kV，加速速率30 kHz，ESI電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描，離子源溫度550℃，檢測(cè)器為TDC40 GHz。

1.5.5 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：將所篩選菌株活化后稀釋涂布至平板上觀察菌落形態(tài)，接種環(huán)挑取菌株純培養(yǎng)物革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

電鏡掃描（scanning electron microscope，SEM）觀察：取適量種子液涂至無(wú)菌載玻片上，用生理鹽水沖洗2遍，2.5%戊二醛浸泡固定8 h。梯度乙醇洗脫（濃度依次為10%，30%，50%，70%，90%），最后用100%乙醇沖洗2遍[23]，空氣中晾干，噴金，電鏡觀察。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏手冊(cè)》[24]對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定：利用DNA抽提試劑盒提取基因組，使用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠，150V、100 mA、20 min電泳觀察。再將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

同源性分析：將序列上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行blast同源序列檢測(cè)，獲得同源性較高菌株16S rDNA序列。應(yīng)用BioEdit軟件分析各16S rDNA序列之間的同源性，并通過(guò)Clustalx 1.83及MEGA 6.0軟件，根據(jù)相似相鄰法則（Neighbor-Joining）構(gòu)建同源性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將序列提交至NCBI網(wǎng)站，獲得登錄ID號(hào)。

1.5.6 菌株發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)

菌株活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃，110 r/min條件下，發(fā)酵6 d。每隔24小時(shí)測(cè)定菌體干重和MK-7產(chǎn)量，繪制發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

豆豉菌液經(jīng)過(guò)80℃水浴30 min后，利用芽孢桿菌的耐熱性進(jìn)行篩選。對(duì)平板涂布法挑選出的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)觀察，挑選染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性，顯微結(jié)構(gòu)為桿狀菌株保存，分離得到29株所需菌株。將初篩芽孢桿菌按照上述條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)HPLC檢測(cè)，在245 nm波長(zhǎng)下，出峰時(shí)間為22.5 min左右，色譜圖如圖2所示。

圖2 菌株產(chǎn)物HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the strain production

與標(biāo)準(zhǔn)品MK-7保留時(shí)間相同菌株共有16株，菌株篩選結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，DC-1菌株MK產(chǎn)量較高，在同等條件下發(fā)酵培養(yǎng)3 d，MK-7產(chǎn)量可達(dá)0.317 mg/L。因此選擇菌株DC-1為目標(biāo)菌株，以該菌株為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

2.2 菌株DC-1發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)C-MS分析結(jié)果

菌株發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)C-MS圖譜總離子流圖與質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

表1 產(chǎn)MK-7菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of the MK-7 producers

圖3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)C-MS圖譜Fig.3 Results of fermentation product by LC-MS

由總離子流圖3（a），質(zhì)量色譜圖3（b）可知，相對(duì)豐度最高的物質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）為648.506 1，其產(chǎn)物與MK-7分子量648.496 0相吻合，因此可以推斷出DC-1菌株在液相色譜22.5 min處洗脫峰對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物為本研究目的產(chǎn)物MK。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株DC-1形態(tài)觀察結(jié)果

宏觀形態(tài)觀察：菌株純培養(yǎng)物觀察如圖4。

由圖4可知，菌落淡黃色，表面無(wú)光澤，有褶皺，中間草帽狀突起，邊緣不規(guī)則，質(zhì)地松軟黏稠，有臭雞蛋氣味。

微觀形態(tài)觀察：菌株DC-1微觀形態(tài)圖如圖5。

圖4 菌株DC-1宏觀菌落形態(tài)圖Fig.4 Macroscopic colony characteristics of the strain DC-1

圖5 菌株DC-1微觀形態(tài)圖Fig.5 Microscopic colony characteristics of the strain DC-1

由圖5結(jié)果可知，顯微鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，桿狀呈鏈狀排布。掃描電子顯微鏡（SEM）利用電子束掃描樣品得到高分辨率的三維結(jié)構(gòu)圖，由圖可以看出DC-1菌株為長(zhǎng)條桿狀，長(zhǎng)度約為1 μm～2.5 μm。

2.3.2 菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株DC-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 DC-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biological characteristics of the strain DC-1

2.3.3 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物測(cè)得基因序列數(shù)目為1 421 bp?；蛐蛄性诨驍?shù)據(jù)庫(kù)（GenaBank）中blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與菌株Bacillus subtilis HMJ-2和Bacillus subtilis IARI-NIAW1-13同源性高達(dá)99%以上。結(jié)合該菌的形態(tài)學(xué)和生理生化特征，鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis DC-1。將該菌的16s rDNA序列提交至GenaBank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到序列ID為MG266437。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相似度高菌株序列，利用MEGE6.0軟件，構(gòu)建同源性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖6所示。

圖6 DC-1菌株同源性分析樹(shù)Fig.6 Homology phylogenetic tree of the strain DC-1

2.3.4 菌株發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)曲線

在37℃，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min條件，Bacillus subtilis DC-1發(fā)酵培養(yǎng)6 d，每隔1天測(cè)定發(fā)酵液中MK-7含量和菌體干重，繪制發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)曲線如圖7。

圖7 Bacillus subtilis DC-1發(fā)酵進(jìn)程監(jiān)測(cè)曲線Fig.7 Fermentation curve of Bacillus subtilis DC-1

由圖7可知發(fā)酵前4天，隨時(shí)間增長(zhǎng)，菌體生物量增加，發(fā)酵液中MK-7含量呈較快速度增長(zhǎng)。而發(fā)酵第4天后，菌體生物量增加緩慢，發(fā)酵液中MK-7含量下降，試驗(yàn)結(jié)果與李拖平等的研究結(jié)果一致[25]，可能由于MK結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在發(fā)酵液中分解，導(dǎo)致發(fā)酵液中MK-7產(chǎn)量降低。由試驗(yàn)結(jié)果可知，菌體發(fā)酵過(guò)程第4天，MK-7產(chǎn)量最高，為0.416 mg/L。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)平板初篩和搖瓶篩選相結(jié)合的方法從發(fā)酵豆豉中篩選出1株產(chǎn)MK菌株DC-1。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化，分子生物學(xué)試驗(yàn)與分析，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。利用HPLC和LC-MS對(duì)菌株發(fā)酵液分析，確定菌株產(chǎn)物為MK-7。Bacillus subtilis DC-1在37℃，110 r/min條件下發(fā)酵4 d，MK-7產(chǎn)量為0.416 mg/L。該菌株具有較強(qiáng)研究意義和廣闊應(yīng)用前景，可為后續(xù)菌種誘變選育，發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化提供原材料，并為從微生物發(fā)酵方向獲得MK提供重要依據(jù)。