HPLC檢測黑皮雞樅菌中的水溶性維生素

李艷

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

雞樅菌（Termitomyces spp.）又叫傘把菇、雞絲菇、蟻巢傘、三壇菌等[1-2]，隸屬于擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，是一種味道鮮美、營養(yǎng)豐富的珍貴野生食用菌[3-4]，主要分布在南亞、東亞、非洲以及南太平洋島嶼等熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國云南省是世界雞樅菌的主要分布區(qū)域之一，種類豐富且產(chǎn)量較大。維生素是一種維持機體正常生理功能所必須的營養(yǎng)物質[5]，它不是構成機體組織和細胞的原料，也不是能量的主要來源，而是一種在物質代謝中起重要作用的調節(jié)物質。絕大多數(shù)維生素在體內不能合成或合成量很少，不能滿足機體的需求，需要通過額外攝入食物來補充，盡管機體需求量很少但一旦攝入量不足就會引起相應的維生素缺乏癥，造成機體的損傷。按照維生素的溶解性可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括維生素C和部分B族維生素（維生素B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸和泛酸），脂溶性維生素包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K等。檢測維生素的方法主要有分光光度法[6]、熒光分析法[7]、薄層層析法[8]和液相色譜法[9-12]等。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）操作簡單、特異性強、準確度高是目前檢測食品中水溶性維生素最常用的方法。大量文獻[13-14]針對雞樅菌中的蛋白質、氨基酸、脂肪、總糖、還原糖、灰分和礦物元素等基礎成分進行了分析研究，至今未見對雞樅菌中維生素類營養(yǎng)成分的分析報道。本研究旨在建立采用HPLC同時定性、定量分析檢測新鮮黑皮雞樅菌和菌粉中7種水溶性維生素的方法，為其深度開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黑皮雞樅菌和菌粉均由河北靈濟食用菌有限公司提供。

維生素C標品（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 B12、煙酸、葉酸標品（分析純）：美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、三乙胺（分析純）：天津永達化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司；試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設備

SHIMADZU高效液相色譜儀（HPLC）LC-20A、Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱：日本島津公司；Spectrum 756p紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ш循環(huán)水式多用真空泵：上海知信實驗儀器技術有限公司；DELTA320pH計：梅特勒·托利多儀器有限公司；ARI140型電子分析天平：美國奧豪斯儀器有限公司；微孔過濾器：天津市南開區(qū)百順百通儀器設備銷售部。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

流動相的配制：稱取6.8 g KH2PO4，溶于1 000 mL水中，得到0.05 mol/L的KH2PO4溶液[15]，用三乙胺調節(jié)pH=6.0。流動相使用前用0.45 μm膜過濾后超聲脫氣15 min。

標準儲備液的配制：分別稱取維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸和葉酸標準品各 10 mg，維生素 C、維生素 B1、維生素 B6、維生素 B12、煙酸直接用水溶解后定容到10 mL棕色容量瓶中，維生素B2和葉酸先用少量0.1 mol/L的NaOH溶液溶解后再用水定容到10 mL棕色容量瓶中，得到濃度均為1 mg/mL的標準品儲備液，儲存于4℃冰箱中備用[16]。

混合標準使用液的配制：分別吸取維生素B1、維生素B12標準儲備液各0.8 mL，維生素B6、煙酸和葉酸標準儲備液各0.4 mL，維生素C、維生素B2標準儲備液各0.1 mL混合在一起得到混合標準使用液，再用水稀釋到所需的濃度，進樣前過0.45 μm膜。

1.3.2 樣品的制備

新鮮黑皮雞樅菌樣品處理：隨機挑選新鮮的黑皮雞樅菌，分成菌蓋、菌腿和完整菌3份樣品，分別切丁，打漿或充分研磨，稱取適量樣品，加45 mL水進行超聲提取30 min，4 500 r/min離心15 min，用布氏漏斗過濾，取濾液定容到50 mL，過0.45 μm膜過濾，進樣。

黑皮雞樅菌菌粉的處理：稱取適量菌粉，加45mL水超聲提取30 min，4 500 r/min離心15 min，用布氏漏斗過濾，取濾液定容到50 mL，過0.45μm膜過濾，進樣。

1.3.3 色譜條件

流動相：A 為 0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH=6.0）；B為甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：268 nm；進樣量：20 μL；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 維生素標準曲線的繪制及檢出限和定量限

取一定量的混合標準使用液稀釋成6個不同濃度值，每個濃度值重復進樣3次取平均值，以響應值峰面積y對質量濃度x作線性方程：y=ax+b，進行線性回歸分析。檢出限（limit of determination，LOD）為3倍信噪比，定量限（limit of quantification，LOQ）為 10倍信噪比。

1.3.5 精密度和回收率

精密度：取20 μg/mL的混合標準使用液連續(xù)進樣6次，以峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來表征方法的精密度。

回收率：采用不含維生素的樣品為基質進行空白加標，分3個濃度值，以外標法計算加標回收率，每個濃度值重復進樣5次，以加標回收率來表征方法的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件進行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗的數(shù)據(jù)均由Excel 2007處理得出。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

通過紫外可見分光光度計對7種水溶性維生素標品溶液進行全波長掃描，最佳吸收波長見表2。

表2 維生素最佳吸收波長Table 2 The best absorption wavelength of vitamins

由表2可知7種水溶性維生素的最佳吸收波長雖不一致，但較為接近，在270 nm左右均有較高的吸光度，因此本研究確定試驗的最終檢測波長為268 nm。

2.1.2 色譜柱的選擇

試驗比較了 Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱和 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱對7種水溶性維生素的分離效果，結果表明使用Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱時，7種維生素實現(xiàn)了良好的分離，分離度大于3且峰形尖銳，因此試驗最終選擇 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱。

2.1.3 流動相pH值的確定

流動相的pH值是影響維生素分離的一個重要因素，試驗研究了不同pH值的流動相KH2PO4溶液對7種水溶性維生素的分離效果，結果表明當pH<6時維生素B1和維生素B6不能完全分離，當pH=6時7種水溶性維生素實現(xiàn)了良好的分離，當pH>6時7種水溶性維生素雖能分離但峰面積有減少的趨勢，且部分維生素特別是維生素C在偏中性條件下不穩(wěn)定，綜合考慮最終確定流動相的pH=6。在調節(jié)pH值時，試驗比較了0.1 mol/L的NaOH溶液和三乙胺對分離效果的影響，結果表明使用三乙胺調節(jié)pH值時，操作更簡單且峰形明顯優(yōu)于NaOH溶液。

2.1.4 流速和柱溫的選擇

研究比較了流動相的流速對7種水溶性維生素分離效果的影響，結果表明，在流速分別為0.6、0.8、1.0 mL/min選擇時，流速為0.6 mL/min分離時間較長且出峰時間靠后；流速為0.8 mL/min和1.0 mL/min時，7種維生素均可在22 min內實現(xiàn)良好分離，考慮到流速越大泵壓越高，對色譜柱和儀器損傷較大，因此最終確定流速為0.8 mL/min。改變柱溫發(fā)現(xiàn)除了保留時間略微縮短之外對維生素的分離和定性定量分析沒有明顯的影響，因此選擇在室溫條件下操作。

2.1.5 梯度洗脫程序的優(yōu)化

試驗首先研究了在等度洗脫條件下7種維生素的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)調節(jié)有機相的濃度進行等度洗脫不能實現(xiàn)維生素的良好分離，因此改為梯度洗脫，并通過對梯度洗脫程序的不斷優(yōu)化最終確定了表1所示的洗脫程序，7種維生素在22 min之內實現(xiàn)了良好分離，且分離度都大于3。

通過對色譜條件的優(yōu)化，7種維生素實現(xiàn)了分離和同時檢測，結果見圖1。

由圖1可知7種維生素均達到了基線分離，可用于維生素的定性定量分析。

2.2 維生素檢測方法的建立

2.2.1 維生素標準曲線的繪制及檢出限和定量限

按照最優(yōu)色譜條件對各維生素標品進行HPLC分析，各維生素的線性相關系數(shù)R2、線性范圍、檢出限LOD、定量限LOQ如表3所示。

圖1 維生素標準品色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of vitamin

表3 各維生素的線性相關系數(shù)、線性范圍、LOD、LOQ及RSDTable 3 The linear correlation coefficient，linear range，detection limit，quantitative limit and relative standard deviation of each vitamin

由表3可知各維生素的線性相關系數(shù)在0.999 6～1.000 0之間，表明線性關系良好，最低檢出限在0.15 μg/mL～1.52 μg/mL 之間，定量限在 0.49 μg/mL～5.08 μg/mL 之間。

2.2.2 精密度和回收率

以峰面積的相對標準偏差RSD來表征方法的精密度，以不含維生素的樣品為基質進行空白加標計算加標回收率，以加標回收率來表征方法的準確性，結果見表4。

表4 各維生素的加標回收率Table 4 Standard addition recovery rate of each vitamin

由表4可知7種維生素的RSD在0.31%～7.04%之間，表明精密度良好[17-18]。由表4可知7種維生素的加標回收率在88.07%～106.01%之間，回收率較高[19-20]，說明方法的準確性良好。

2.3 雞樅菌中水溶性維生素含量的測定

按照1.3.2所述方法對樣品進行處理后，按照所建立的方法對樣品進行檢測，以保留時間進行定性，以外標法進行定量，新鮮黑皮雞樅菌及菌柄、菌傘和菌粉中水溶性維生素含量的檢測結果見表5。

表5 雞樅菌中水溶性維生素含量Table 5 The content of water soluble vitamin in Termitomyces spp.

由表5可知，新鮮黑皮雞樅菌中檢測到4種水溶性維生素，菌粉中檢測到5種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。新鮮黑皮雞樅菌及菌粉中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的86.47%和87.97%，其中維生素C的含量分別占總維生素含量的59.37%和50.62%，維生素C能夠維持免疫功能，保持血管完整，促進非血紅素鐵的吸收，同時維生素C還具有抗氧化，抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成等功能，從而達到美白，淡斑的功效。煙酸的含量分別占總維生素含量的27.10%和37.35%，煙酸有較強的擴張周圍血管的能力，能維持消化系統(tǒng)的健康、減輕胃腸道障礙，同時還可以預防和緩解嚴重的偏頭痛且對緩解皮炎和腹瀉癥狀具有明顯的效果。由此可見，多食用以雞樅菌為主要原料的產(chǎn)品對于維持機體正常功能、保護胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。菌粉中葉酸含量占總維生素含量的1.82%，而新鮮黑皮雞樅菌中未檢測到葉酸，可能是由于新鮮黑皮雞樅菌中葉酸含量過低超出了該方法的檢出限。

完整的黑皮雞樅菌主要由菌柄和菌傘兩部分組成，菌柄和菌傘也都檢測到4種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。菌柄和菌傘中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的88.57%和86.92%，其中維生素C含量分別占總維生素含量的52.90%和64.47%，煙酸含量分別占總維生素含量的35.67%和22.45%。進一步分析發(fā)現(xiàn)菌傘中維生素C的含量是菌柄中維生素C含量的1.48倍，維生素B2含量是菌柄中含量的3.40倍；菌柄中煙酸含量是菌傘中煙酸含量的1.31倍，維生素B1含量是菌傘中含量的1.22倍。菌傘中總維生素含量是菌柄中總維生素含量的1.21倍。以上數(shù)據(jù)為黑皮雞樅菌不同部位營養(yǎng)價值的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3 結論

本試驗建立了一種簡單、快速、準確并可同時檢測7種水溶性維生素的方法，利用此方法對新鮮黑皮雞樅菌、菌粉、菌柄和菌傘進行定性和定量分析，結果表明黑皮雞樅菌水溶性維生素含量豐富且以維生素C和煙酸為主，維生素C和煙酸對于維持機體正常功能、保護胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。檢測方法的建立和檢測數(shù)據(jù)結果為黑皮雞樅菌的開發(fā)利用和深度加工奠定了一定的理論基礎。