一種含有富里酸及腺苷的葛花解酒產(chǎn)品的研制

（營口理工學院化學與材料工程系，遼寧營口115014）

飲酒已經(jīng)成了人們生活中的一部分，酒精中毒和飲酒過度所引發(fā)的系列問題已經(jīng)危害到人們的生活，尋找解除或降低乙醇對人體損害的解酒物質(zhì)是近年來的研究熱點[1-10]。葛花（Puerariae flos）又名葛條花，是豆科類植物。葛花中的化學成分主要是黃酮類化合物、皂苷類化合物、揮發(fā)油類化合物、氨基酸、甾醇類化合物、生物堿等，其中黃酮類化合物含量居多[11-13]。葛花不僅有解酒保肝的功效，對消化系統(tǒng)也有一定的作用。富里酸是天然的有機化合物，含有氨基、羧基、羥基等多種基團，其可廣泛地應用在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療、環(huán)保、食品等領(lǐng)域，同時還具有醒酒防醉、提高機體免疫力、促進纖維細胞的生長、消炎、調(diào)節(jié)機體代謝功能等作用[14-17]。

腺苷是一種內(nèi)源性核苷，它遍布人體細胞，可直接進入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，有益腎保肺、降血脂、抗心律失常作用。目前，對擬青霉菌中腺苷的提取與檢測報道較少[18-19]，課題組采用從富里酸擬青霉菌中得到的腺苷，與葛花提取液、富里酸復配研制解酒產(chǎn)品，不僅可以解決醉酒傷身的問題，而且將有很好的開發(fā)應用價值。

1 儀器和材料

1.1 儀器

BLF-YB500高速多動能粉碎機：深圳百利福工貿(mào)有限公司；JY系列電子天平、CTH1650臺式高速離心機：上海方瑞儀器有限公司；BILON-ZCW-1000W微波·超聲·紫外光催化合成儀：上海比朗儀器有限公司；FD-1C冷凍干燥機：鞏義市予華儀器有限公司；S6000高效液相色譜儀：華譜科儀（北京）科技有限公司；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 材料

葛花：亳州市永剛飲片廠有限公司；瓊脂、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；紅糖：廣西上上糖業(yè)有限公司；腺苷（99%）：北京百靈威科技有限公司；42°白酒：北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司；甲醇（色譜純試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；富里酸：營口理工學院化學與材料工程系應用化學實驗室自制。

1.3 實驗動物

小鼠（體重20 g～25 g）：中國醫(yī)科大學。

2 試驗方法

2.1 葛花有效成分提取

葛花有效成分的提取采用水做溶劑，使用微波、超聲協(xié)同輔助提取。準確稱取粉碎過篩（80目）的葛花粉進行微波和超聲輔助提取。

微波和超聲輔助提?。簩⒋嵛锓湃胩崛∑恐邪惭b好儀器，設(shè)置試驗參數(shù)，其中微波功率400 W，超聲波功率300 W，溫度80℃，時間20 min；收集上清液，將上清液冷凍干燥，計算水溶物提取率，水溶物提取率/%=（水溶物質(zhì)量/干葛花粉質(zhì)量）×100；將提取物封口備用。

2.2 富里酸擬青霉菌的培養(yǎng)與干菌的制備

2.2.1 富里酸擬青霉菌的培養(yǎng)

菌種為富里酸擬青霉菌，是從富里酸中篩選出，用沙氏固體培養(yǎng)基接種好的，為保藏菌種，選擇紅糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2.1.1 培養(yǎng)基的制作

紅糖液體培養(yǎng)基：稱量紅糖→加水加熱溶解→定容→取液→封口滅菌→取出備用稱取40 g紅糖，10 g蛋白胨放入1 L燒杯中，加入500 mL純水，加熱煮沸后，再加純水定容到1 L，完全溶解后，取100mL的液體培養(yǎng)基分別倒入10個250mL的錐形瓶中，用紗布4層～8層封好瓶口，放入滅菌鍋里滅菌30 min，滅菌后放入超凈臺備用。

2.2.1.2 富里酸擬青霉菌培養(yǎng)

待滅菌好的紅糖液體培養(yǎng)基冷卻至室溫后開始接菌，將之前在冰箱保存好的富里酸擬青霉菌種（在沙氏瓊脂培養(yǎng)基接種的菌種）取出，在超凈臺上操作：點燃酒精燈，先用棉花擦手；用火燒一下接種針，待接種針冷卻至室溫，使用接種針在沙氏培養(yǎng)基菌種上刮一下，將接種針上的菌種放入紅糖液體培養(yǎng)基中，接種完成，用紗布封好瓶口，貼上標簽“①號菌”；放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)36 h以形成菌膜，備用。其余9個液體培養(yǎng)基按相同接種方法接種，分別貼上標簽②～⑩號菌，恒溫培養(yǎng)，備用。

2.2.2 干菌的制備

將①～⑩號菌中的菌膜取出，用純凈水洗去菌膜上殘留的培養(yǎng)液后，放置到冷凍干燥儀中冷凍干燥12 h，即得到干菌，收集備用。

2.3 富里酸擬青霉菌中腺苷的提取與檢測

2.3.1 擬青霉菌腺苷的提取

1）準確稱取富里酸擬青霉菌干菌0.0314g加入30mL純凈水混合。

2）混合液放入反應器-微波·超聲·紫外光催化合成儀中，采用微波和超聲波協(xié)同提取擬青霉菌腺苷，設(shè)置提取條件，其中微波功率400 W，超聲波功率400 W，溫度80℃，時間10 min。

3）高速離心過濾，收集上清液，標記為待測液。

2.3.2 腺苷檢測

1）采用高效液相色譜法檢測腺苷，色譜條件：色譜柱為 Waters×Bridge C18柱，4.6 mm×250 mm 半微型色譜柱（5 μm）；檢測器為紫外檢測器；檢測波長260 nm；流動相為水-甲醇（85∶15，體積比）；柱溫 30℃；流速0.5 mL/min；

2）腺苷標準溶液配制

用電子天平準確稱取腺苷標準品0.020 0 g，加超純水溶解并定容至50 mL，此溶液每1 mL含0.4 mg腺苷；分別吸取 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 mL 于 100 mL 容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，可得0.000 4 mg/mL～0.06 mg/mL系列標準溶液。

3）標準樣品分析

系列標準樣品分別按色譜條件進樣，記錄色譜圖，并根據(jù)系列標準品色譜圖制作標準曲線。

4）待測樣品分析

待測樣品（樣品液用濾膜過濾后裝入測試樣瓶中待測，分別是待測液1、待測液2、待測液3）分別按色譜條件進樣，記錄色譜圖，外標法以峰面積檢測是否含有腺苷并分析不同提取條件下腺苷的含量，得出最佳提取條件。

2.4 解酒產(chǎn)品復配及其對醉酒小鼠的動物實驗

2.4.1 解酒產(chǎn)品復配液的制備

1）解酒產(chǎn)品成分：葛花提取液（2.1中制備）、擬青霉菌腺苷提取液（采用2.3中腺苷提取方法中的最佳提取條件處理菌液，高速離心過濾后收集上清液封口備用）、富里酸。

2）解酒產(chǎn)品復配

A液標號：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶3∶3（體積比）

B液標號：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶1∶5（體積比）

C液標號：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）

D液標號：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶去離子水=1∶2∶4（體積比）

E液標號：葛花提取液∶去離子水∶富里酸=1∶2∶4（體積比）F液標號：葛花提取液∶去離子水=1∶6（體積比）復配條件：常溫，混合各組分后均勻攪拌即可。

2.4.2 解酒實驗設(shè)計

采用微波和超聲波協(xié)同提取葛花異黃酮類化合物，高速離心過濾后所得濾液為25 mL，已知冷凍干燥后的水溶物質(zhì)量為0.146 8 g，由此可得提取液中有效成分濃度為5.872 g/L；富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波共同處理后，采用高效液相色譜儀檢測可知每0.01 mL擬青霉菌腺苷提取液中腺苷含量為0.004 mg，因此提取液中腺苷濃度為0.4 g/L；自制富里酸的濃度3 g/L。

由預實驗得到最適致醉量為0.15 mL乙醇/10 g體重。

將實驗小鼠禁食12小時后進行解酒實驗，觀察小鼠從醉酒到醒酒時間內(nèi)的狀態(tài)并記錄醒酒時間。取小鼠70只，稱重標記后隨機分為7組（分別為模型對照組、實驗組1、實驗組2、實驗組3、實驗組4、實驗組5、實驗組6），每組10只。設(shè)計7種處理方案：

①模型對照組：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重生理鹽水；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

②實驗組1：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重A液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

③實驗組2：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重B液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

④實驗組3：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重C液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑤實驗組4：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重D液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑥實驗組5：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重E液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑦實驗組6：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重F液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

2.4.3 小鼠醉酒、醒酒判斷

以“翻正反射”實驗判斷小鼠醉酒、醒酒狀態(tài)[20]。給小鼠灌酒后，將其背部向下放在實驗臺上，如果該姿勢保持30 s以上就認為翻正反射消失，此時小鼠為醉酒狀態(tài)，反之小鼠未醉。給酒后一段時間，當小鼠出現(xiàn)走路不穩(wěn)，站立也不穩(wěn)，尾巴拖地現(xiàn)象時，稱為拖尾現(xiàn)象。醉酒小鼠出現(xiàn)翻正反射消失的時間為醉酒耐受時間。灌酒后翻正反射消失到恢復的時間為醒酒時間。

3 結(jié)果與討論

3.1 葛花提取液中水溶物含量的分析

葛花粉與去離子水按固液比1∶15（g/mL）混合后，分別采用微波和超聲波共同提取、僅超聲提取、僅微波提取的方法進行比較研究。3種方法提取結(jié)束后，將葛花提取液高速離心，取上清液（濾液）進行冷凍干燥12 h，稱量干燥后的粉末質(zhì)量。

計算提取率。不同提取方法的提取液中水溶物含量如表1所示。

表1 葛花不同提取方法水溶物成分含量Table 1 Pueraria lobata flowers water soluble component content under different extraction methods

結(jié)果顯示，3種提取條件的提取率由高到低為：微波和超聲波>微波>超聲波，采用微波和超聲波協(xié)同提取方法所得水溶物含量最大，提取率可達7.34%，因此復配液中葛花提取液采用微波和超聲波協(xié)同提取法提取制備。

3.2 富里酸擬青霉菌中腺苷的檢測結(jié)果分析

將配置的不同濃度的標準溶液，濃度分別為0.0004、0.002、0.004、0.02、0.04、0.06 mg/mL 腺苷標樣，按 2.3.2色譜條件進樣0.01 mL，以時間為橫坐標，吸光率為縱坐標記錄色譜圖。圖1為0.004 mg/mL腺苷標樣的色譜圖，根據(jù)不同濃度的譜圖可做出標準曲線。

圖1 0.004 mg/mL腺苷標樣色譜圖Fig.1 0.004 mg/mL adenosine sample chromatogram

采用微波和超聲波協(xié)同提取腺苷后，使用高效液相色譜儀進行檢測，利用ESTD計算法，通過與標準譜圖對比分析發(fā)現(xiàn)含有腺苷，通過標準曲線計算出當進樣0.01 mL時，腺苷含量為0.004 mg，色譜圖如圖2所示。

3.3 解酒復配液對小鼠解酒效果分析

3.3.1 各組復配液對小鼠醉酒率的結(jié)果比較

根據(jù)“翻正反射”實驗來判斷小鼠的醉酒、醒酒狀態(tài)，記錄各組小鼠醉酒只數(shù)，得出各組復配液對小鼠醉酒率的影響。實驗結(jié)果如表2所示。

圖2 微波和超聲波協(xié)同提取腺苷色譜圖Fig.2 Microwave and ultrasonic synergistic extraction of adenosine chromatogram

表2 各組復配液對小鼠醉酒率的影響Table 2 The effect of the compound solution on the intoxication rate

表3 各組復配液對小鼠醉酒、醒酒時間的影響Table 3 The effect of the compound solution on intoxication and decanting time of mice

續(xù)表3 各組復配液對小鼠醉酒、醒酒時間的影響Continue table 3 The effect of the compound solution on intoxication and decanting time of mice

參照2.4.1解酒產(chǎn)品復配液的制備及模型對照組的配比，由表2得到結(jié)果，可以說明模型對照組用生理鹽水灌胃小鼠無防醉作用；實驗組4～實驗組6采用葛花提取液或與擬青霉菌腺苷提取液、富里酸單獨復配的防醉作用不明顯；實驗組1～實驗組3同時采用葛花提取液、擬青霉菌腺苷提取液和富里酸防醉作用明顯提高，說明擬青霉菌腺苷和富里酸在小鼠防醉作用中起到了主要作用；實驗組3與其余實驗組相比，醉酒率最低，防醉效果最好；實驗組3[葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）]配比中擬青霉菌腺苷與富里酸對小鼠起到了協(xié)同增效的防醉作用。

3.3.2 各組復配液對小鼠醒酒結(jié)果的比較

記錄各組小鼠醉酒時間（拖尾時間）、醒酒時間，記錄小鼠整個實驗過程的狀態(tài)，記錄如表3所示。

結(jié)果顯示，與模型對照組相比，實驗組1～實驗組6的醉酒時間（拖尾時間）均有所延長，并且實驗組3呈現(xiàn)顯著差異，而其余實驗組差異不太顯著；醒酒時間，實驗組1～實驗組6醒酒時間均有所減少，且實驗組3差異明顯，由此可得出，復配液最佳配比為：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）時，解酒效果最好。

3.4 最佳條件下復配液各成分含量分析

1）復配液最佳配比為：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比），復配液中富里酸含量達到57.14%，擬青霉菌腺苷提取液占28.57%，葛花提取液占14.29%，該比例所配置的解酒產(chǎn)品解酒效果最佳。

2）采用微波和超聲波協(xié)同提取葛花有效成分，高速離心過濾后所得濾液為25 mL，冷凍干燥后的水溶物質(zhì)量為0.146 8 g，由此可得提取液中葛花有效成分含量為：0.005 872 g/mL；富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波共同處理后，利用高效液相色譜儀檢測可知每0.01 mL擬青霉菌腺苷提取液中腺苷含量為0.004 mg，因此提取液中腺苷濃度為：0.000 4 g/mL。得出配置7 mL解酒產(chǎn)品各組分中有效成分的含量如表4。

表4 各組分有效成分含量Table 4 Effective component content for compound solution

由表4可知，除富里酸外，葛花水溶物有效成分含量較高，擬青霉菌腺苷含量較低，這些有效成分在解酒產(chǎn)品中起主要解酒功效。

4 結(jié)論

1）葛花水溶物采用微波和超聲波協(xié)同提取，提取率可達7.34%；將紅糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波協(xié)同提取，每0.01 mL試樣中含有腺苷量可達0.004 mg。

2）通過醉酒小鼠“翻正反射”實驗得出葛花解酒產(chǎn)品復配液最佳配比為，葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比），其中葛花提取液濃度為5.872 g/L，腺苷的濃度為0.4 g/L；自制富里酸的濃度3 g/L。實驗證明該配比對醉酒小鼠有顯著的解酒作用，且除了葛花天然的解酒作用外，富里酸及擬青霉菌腺苷在解酒功效上有協(xié)同增效的作用；實驗采用先給藥后給酒的灌胃方法，還在一定程度上體現(xiàn)出該配方產(chǎn)品有防醉功效，因此具有很好的市場價值。