纖維素酶輔助提取柚葉總黃酮的工藝研究

陳建福，曾勤，2，吳麗敏，曾小芳，

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建漳州363000；2.福建省精細(xì)化工應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建漳州363000；3.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州363000）

柚是蕓香科常綠喬木植物，分布于我國廣東、福建、浙江、湖南和廣西等14個省區(qū)[1]。柚子營養(yǎng)豐富，全身是寶，其果實除可以鮮食或加工外，其果皮、樹葉、樹根等都含有一定量的精油、黃酮和多酚等多種天然活性物質(zhì)[2-3]。柚葉本身苦澀，無法直接食用，因此更要注重深加工等綜合利用，柚葉中含有黃酮類物質(zhì)，是一種理想的黃酮類物質(zhì)的原材料[4]。黃酮是廣泛存在植物中的一種天然活性成分，具有抗菌、擴張血管、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗癌等多種生理功效，引起人們的廣泛關(guān)注[5-6]。另外，植物中有效成分會因植物的品種、產(chǎn)地等不同而具有不同的產(chǎn)量，為充分利用漳州琯溪蜜柚葉資源，開發(fā)出新的柚葉深加工產(chǎn)品，本文以漳州產(chǎn)琯溪蜜柚葉為材料，利用超聲波對柚葉總黃酮進行提取，并在超聲波提取的基礎(chǔ)上，繼續(xù)使用纖維素酶對柚葉進行預(yù)處理，并用響應(yīng)面優(yōu)化酶預(yù)處理的工藝條件，為柚葉總黃酮的提取與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚葉：采于漳州市平和縣的琯溪蜜柚；纖維素酶（食品級，1萬U/g）：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品）：上海滬宇生物試劑公司；其它試劑均為分析純。

UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；KQ-100DE超聲波：江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；EL-20實驗室pH計：梅特勒-托利多上海有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，用70%乙醇溶解，置于100 mL的容量瓶中，定容至刻度線，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5 mL置于50 mL的容量瓶中，定容至刻度線，配成0.1 g/L的蘆丁母液。分別從中取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的溶液置于試管中，再依次添加濃度為70%的乙醇至5.0 mL，此時溶液的濃度分別為0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。依次加入0.3 mL 5%的NaNO2，搖勻后靜置5 min，加入0.3 mL

式中：b為總黃酮質(zhì)量濃度，mg/L；V為提取液體積，L；m 為柚葉的質(zhì)量，g。

1.2.3 超聲波輔助提取方法

將采摘的琯溪蜜柚葉浸泡于蒸餾水，洗凈，自然晾干，并于50℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎，取60目～80目之間的粉末，備用。稱取一定量的柚葉粉末裝入100 mL的圓底燒瓶中，置于超聲波清洗器中進行提取，提取結(jié)束后，按1.2.1和1.2.2計算得總黃酮提取率。利用響應(yīng)面對該工藝進行優(yōu)化，得到了最佳工藝條件。

1.2.4 纖維素輔助提取柚葉多酚

利用纖維素酶對柚葉進行預(yù)處理，預(yù)處理完后，在最佳的超聲工藝條件下，對柚葉總黃酮進行提取，并計算得到柚葉總黃酮的提取率。

1.2.4.1 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

固定酶解時間60 min、酶用量3%、pH 5.6的條件下，考察不同酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.2 酶解時間對總黃酮提取率的影響

固定酶解溫度55℃、酶用量3%、pH 5.6的條件下，考察不同酶解時間（20、40、60、80、100 min）對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.3 酶用量對總黃酮提取率的影響

固定酶解溫度55℃、酶解時間60 min、pH 5.6的條件下，考察不同酶用量（1%、2%、3%、4%、5%）對總黃酮提取率的影響。

1.2.4.4 pH值對總黃酮提取率的影響

固定酶解溫度55℃、酶解時間60 min、酶用量3%10%的Al（NO3）3，搖勻靜置6 min，再依次添加2 mL 4%的NaOH，搖勻，繼續(xù)添加70%的乙醇至10 mL，靜置15 min。置于510 nm吸光度下進行比色，測定吸光度并進行線性擬合得到回歸方程y=7.614 2x+0.000 3，R2=0.999 8。

1.2.2 柚葉總黃酮的測定

按上述回歸方程測定提取所得的柚葉提取液，計算出柚葉總黃酮的提取率。的條件下，考察不同 pH（4.8、5.2、5.6、6.0、6.4）對總黃酮提取率的影響。

1.3 響應(yīng)面的因素與水平設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對影響柚葉黃酮提取率的酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶用量（C）和 pH（D）4個變化因素進行設(shè)計。表1為響應(yīng)面設(shè)計因素編碼及水平表。

表1 因素與水平表Table 1 Table of Factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對黃酮提取率的影響

酶解溫度對黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 酶解溫度對黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on yield of total flavonoids

由圖1可以看出，酶解溫度在45℃～55℃范圍內(nèi)，總黃酮的提取率逐漸上升，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃時，總黃酮的提取率達(dá)到最大，酶解溫度繼續(xù)升高到55℃～65℃，總黃酮提取率逐漸下降。這是因為隨著酶解溫度的升高，酶的活性越高，對原料作用越充分，提取率提高；而酶有一個最適作用溫度，當(dāng)溫度過高時，酶的活性會降低，從而使得總黃酮提取率降低[7]。因此酶解溫度選擇為55℃。

2.1.2 酶解時間對黃酮提取率的影響

酶解時間對黃酮提取率的影響見圖2。

由圖2可以看出，酶解時間在20 min～60 min范圍內(nèi)，總黃酮的提取率逐漸上升，當(dāng)酶解時間達(dá)到60 min時，總黃酮的提取率達(dá)到最大，酶解時間繼續(xù)延長到在60 min～100 min時，總黃酮提取率又開始下降。這是因為酶解時間較短時，酶與柚葉作用還沒有完全，酶活力得不到體現(xiàn)，總黃酮提取率較低，隨著酶解時間的延長，總黃酮提取率提高，但過長的酶解時間，總黃酮提取率無法再提高，甚至出現(xiàn)了下降[8]，最佳的酶解時間選擇為60 min。

2.1.3 酶用量對黃酮提取率的影響

酶用量對黃酮提取率的影響見圖3。

圖2 酶解時間對黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time on yield of total flavonoids

圖3 酶用量對黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of cellulase dosage on yield of total flavonoids

由圖3可以看出，酶用量在1%～3%范圍內(nèi)，總黃酮的提取率逐漸上升，當(dāng)酶濃度達(dá)到3%時，總黃酮的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶濃度到3%～5%時，總黃酮提取率又開始下降。這是因為隨著纖維素酶用量的增加，纖維酶與更多的柚葉細(xì)胞壁作用，促進了柚葉顆粒內(nèi)黃酮的溶出，提高總黃酮提取率；而當(dāng)纖維素酶用量過大時，酶與底物的作用達(dá)到飽和，酶解作用受到抑制，降低了黃酮的提取率[9]，最佳的酶用量選擇為3%。

2.1.4 pH值對黃酮提取率的影響

pH值對黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4中可以看出，pH值在4.8～5.6范圍內(nèi)，總黃酮的提取率逐漸上升，當(dāng)pH值達(dá)到5.6時，總黃酮的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加pH值到5.6～6.4時，總黃酮提取率又開始下降。這是因為酶是一種蛋白質(zhì)，有適宜的pH范圍，在柚葉總黃酮提取過程中纖維素酶在pH值為5.6時為最適宜，過高或過低的pH值，酶的活性都會降低[10]，最佳的pH值選擇為5.6。

圖4 pH值對黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of pH on yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗

用Design-Expert 8.0b軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。利用其中Box-Behnken試驗的四因素三水平試驗共29個試驗點，其中24個為析因試驗，5個為中心點試驗。自變量取值在A，B，C，D所構(gòu)成的三維頂點；后5個為區(qū)域的中心點，用來估計試驗誤差。柚葉黃酮提取率見表2。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 2 The result of Box-Behnken experiment

續(xù)表2 Box-Behnken試驗結(jié)果Continue table 2 The result of Box-Behnken experiment

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis

對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行分析得響應(yīng)值黃酮提取率（Y）與 酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶用量（C）、pH值（D）4個因素的二次多項式回歸模型為：

由回歸方程的方差分析（見表3）可知，F(xiàn)=28.75，P<0.000 1達(dá)到了極顯著水平，說明該回歸方程能夠正確反映柚葉總黃酮提取率與各工藝條件之間的關(guān)系。失擬項P=0.330 2>0.05，不顯著，表明回歸方程與試驗值擬合較好，試驗誤差小。模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.966 4，表明試驗值與預(yù)測值之間有較好的擬合度，校正系數(shù)R2adj為0.932 8，表明有93.28%的總黃酮提取率變異分布與所研究的4個工藝因素相關(guān)。一次項A、B、D，二次項 A2、B2、C2、D2差異極顯著；交互項 AD、CD差異顯著，一次項C，交互項AB、AC、BC、BD差異不顯著，說明柚葉總黃酮提取率與所考察的酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值之間不是簡單的線性關(guān)系。根據(jù)表中的F值及P值，可以看出影響因素的主次順序為：酶解溫度>酶解時間>pH值>酶用量。綜述分析，說明采用響應(yīng)面法設(shè)計與預(yù)測的回歸模型具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.2.2 響應(yīng)面分析

利用響應(yīng)面及等高線可以直觀地反映出酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值各因素之間的交互作用關(guān)系，利用Desing-Expert 8.05b軟件作出響應(yīng)面圖及等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of factors interactive on yield of total flavonoids

從圖5中可以看出，隨著各因素水平的升高或延長，柚葉總黃酮的提取率均出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，根據(jù)圖中等高線圖顯示，等高線沿酶解溫度軸向變化相對密集，沿酶解時間、pH值、酶用量軸向變化相對稀疏，再從響應(yīng)面的陡峭程度，可以得出，酶解溫度對柚葉總黃酮提取率的影響要大于酶解時間、pH值和酶用量。同理從圖中可以得出酶解時間對柚葉總黃酮的提取率要大于pH值和酶用量，pH值對柚葉總黃酮提取率的影響要大于酶用量，驗證了單因素及交互作用對柚葉總黃酮提取率的主次順序。

2.2.3 驗證試驗

根據(jù)Design-expert 8.0b軟件對所得的二次回歸方程進行分析得到纖維素酶輔助提取柚葉總黃酮的最佳工藝為酶解溫度56.13℃、酶解時間64.15 min、酶用量3.04%和pH 5.52，在此條件下，根據(jù)回歸方程得到的柚葉總黃酮的提取率為38.79 mg/g。考慮實際的操作的局限性與便利性，將最佳提取工藝條件修正為酶解溫度56℃，酶解時間64 min，酶用量3%和pH 5.5，在該條件下進行3次重復(fù)驗證試驗，測得柚葉總黃酮提取率為38.62 mg/g，與理論值（38.79 mg/g）相對誤差為0.44%，說明該模型具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，因此可以利用響應(yīng)面法對柚葉總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。

3 結(jié)論

考察酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值對柚葉總黃酮提取率的影響，利用Box-Behnken試驗設(shè)計對酶解工藝中各影響因素進行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了四元二次回歸方程，并通過方差和響應(yīng)面分析分析得到影響柚葉總黃酮提率的主次順序為：酶解溫度>酶解時間>pH值>酶用量。通過Box-Behnken組合設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳的工藝條件為酶解溫度56℃，酶解時間64 min，酶用量3%，pH 5.5，在該條件下測得柚葉總黃酮提取率為38.62 mg/g，與理論值（38.79 mg/g）相對誤差為0.44%，說明該模型具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，可能利用該模型對柚葉總黃酮的提取工藝進行分析與預(yù)測。