人參皂苷Rh2促進人子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡及其機制研究

王 敏

人參是最重要的中藥材之一，有多種藥理作用，在臨床中應(yīng)用廣泛。人參的主要生物學(xué)活性依賴于人參皂苷，人參皂苷屬于三萜皂苷，具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、促進血管舒張、對部分腫瘤的抗癌活性等[1-5]。人參皂苷有多種活性成分，包括Rh1、Rh2、Rg1、Rg3和其他成分等。既往研究顯示，人參皂苷分子糖基數(shù)目越少，其抗腫瘤活性越好[6-7]。人參皂苷Rh2對多種腫瘤細胞均有顯著的增殖抑制活性，但是其作用機制尚未明確[7-8]。此外，人參皂苷Rh2對子宮內(nèi)膜癌的治療效應(yīng)及其分子機制尚不清楚。因此，本研究中探討了人參皂苷Rh2對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的抑制活性及其誘導(dǎo)細胞凋亡的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 體外細胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC1A，購于ATCC；采用DMEM培養(yǎng)液，補加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素。細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，取對數(shù)生長期細胞進行相關(guān)實驗。

1.2 CCK-8檢測細胞抑制率 使用96孔板按3000個/孔接種HEC1A細胞，孵育24 h，待細胞貼壁生長。按照相應(yīng)設(shè)計濃度加入含人參皂苷Rh2的培養(yǎng)基，孵育相應(yīng)時間后，更換100 μl培養(yǎng)基（含10 μl CCK-8 溶液），孵育 30 min，酶標儀（Immunoskan340型，英國BDSL公司）檢測450 nm處光密度D值，并計算細胞增殖抑制率。實驗設(shè)置5個復(fù)孔，并獨立重復(fù)3次。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 相等數(shù)量細胞分別接種于培養(yǎng)皿中，待生長融合至40%～50%時，更換含不同濃度人參皂苷Rh2的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24或48 h。收集全部細胞（含懸浮細胞），再重懸為100 μl細胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI染液，室溫避光反應(yīng)15 min，補充400 μl PBS后，使用流式細胞儀（FC500Mcl型，美國Beckman Coulter公司）檢測凋亡細胞率。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 收集相應(yīng)處理的HEC1A細胞，加入PIPA裂解液，置于冰上震蕩裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，收集蛋白上清。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。使用聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液混勻蛋白樣品，沸煮 10 min保存蛋白樣本。采用SDS-PAGE、濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)膜硝酸纖維素濾膜，使用5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫下脫色搖床上封閉1 h。加入cleaved PARP和caspase-3單克隆抗體(美國 Cell SignalingTechnology公司)4℃孵育過夜，加入1:2000辣根過氧化酶標記的山羊抗兔抗體(美國Pierce公司)室溫孵育1 h。最后，采用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh2對HEC1A細胞增殖的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，隨人參皂苷Rh2濃度升高，HEC1A細胞增殖的抑制效果顯著增強；采用同一濃度人參皂苷Rh2處理時，HEC1A細胞的增殖抑制效應(yīng)隨處理時間延長而增強。提示人參皂苷Rh2可以顯著抑制HEC1A細胞增殖，其抑制效果呈現(xiàn)顯著的濃度-時間依賴性（表1）。

表1不同濃度人參皂苷Rh2對HEC1A細胞增殖的抑制率（%）

2.2 人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HEC1A細胞凋亡 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，用20 μM或40 μM人參皂苷Rh2分別處理HEC1A細胞24 h或48 h，結(jié)果顯示，處理48 h誘導(dǎo)的細胞凋亡率明顯升高(P<0.01，圖1、2)，提示人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HEC1A細胞凋亡呈現(xiàn)時間依賴性。但是，兩濃度人參皂苷Rh2處理24或48 h之間比較，HEC1A細胞凋亡率無顯著差異（P>0.05）。

2.3 人參皂苷Rh2對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

免疫印跡實驗結(jié)果顯示，隨著人參皂苷Rh2處理時間延長，激活性的PARP和caspase-3蛋白水平顯著升高（圖3），提示人參皂苷Rh2通過增強caspase-3和PARP的活化，誘導(dǎo)HEC1A細胞的凋亡。但是，兩濃度人參皂苷Rh2處理24或48 h之間比較，caspase-3和PARP蛋白水平無顯著差異（P>0.05）。

圖3 不同濃度和時間人參皂苷Rh2對HEC-1A細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

圖1 流式細胞術(shù)檢測不同濃度人參皂苷Rh2處理HEC1A細胞的各時間點的細胞凋亡率

3 討論

本研究結(jié)果表明，人參皂苷Rh2可以促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，且呈現(xiàn)出顯著的時間依賴性和一定水平的劑量依賴性。其作用機制可能是，人參皂苷Rh2通過增強caspase-3和PARP活化，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。

作為人參皂苷主要抗腫瘤活性成分，Rh2對多種腫瘤具有顯著的增殖抑制作用。相比有兩個糖基的其他人參皂苷成分，僅有一個糖基的Rh2顯示出更強的促凋亡活性[6]。既往研究顯示，Rh2通過調(diào)控細胞自噬、β-catenin信號通路、抑制MMP13，進而抑制多種腫瘤細胞的增殖速度[9-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2抑制子宮內(nèi)膜癌增殖活性，與其誘導(dǎo)細胞凋亡存在顯著相關(guān)性。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡。在凋亡相關(guān)細胞通路激活后，半胱天冬酶（caspases）裂解活化[12]。凋亡細胞通常呈現(xiàn)為細胞體積縮小、變形[13]，其過程涉及一系列分子的級聯(lián)反應(yīng)，包括形態(tài)學(xué)改變、染色質(zhì)凝聚和DNA碎裂等[14]。細胞凋亡的異常調(diào)控可導(dǎo)致多種疾病，包括惡性腫瘤。因此，靶向細胞凋亡機制是腫瘤治療的重要策略[15]。

caspase活化受到多種細胞因子的調(diào)控。caspase級聯(lián)反應(yīng)是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個關(guān)鍵步驟，可分為兩個亞群：上游起始半胱天冬酶和下游效應(yīng)半胱天冬酶，直接與終末凋亡過程相關(guān)[16]。caspase級聯(lián)反應(yīng)的程序性細胞死亡過程中，其核心成分是凋亡蛋白酶激活因子（apaf-1）復(fù)合物的形成和Bcl-2家族異二聚體蛋白的形成[17]，調(diào)控半胱天冬酶的激活[18]。bcl-2相關(guān)蛋白按照功能分為兩組：抑制或促進細胞凋亡蛋白。細胞凋亡過程中，細胞色素C的細胞質(zhì)易位促使apaf-1復(fù)合體的形成，激活caspase-9，然后激活其他半胱天冬酶[19]。最終，半胱天冬酶裂解活化發(fā)生程序性細胞死亡。多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是半胱天冬酶的底物，在細胞凋亡過程中裂解成為蛋白片段[20]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，與casepase-3和PARP活化相關(guān)，這可能是人參皂苷Rh2抗腫瘤活性的重要機制之一。

總之，人參皂苷Rh2可以顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的體外增殖，其作用機制與誘導(dǎo)細胞凋亡相關(guān)。人參皂苷Rh2是促進腫瘤細胞凋亡的天然化合物，是一種很有前途的天然抗癌藥物，值得進一步臨床研究。