丹參注射液對哮喘大鼠氣道重塑及肺泡灌洗液中TGF-β1的影響*

魏海龍 李秀珍 鮑春英 李利瓊 劉濤

(1.樂山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 四川 樂山614000；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004；3.沈陽積水潭醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 遼寧 沈陽110016；4.延安大學醫(yī)學院藥理學教研室， 陜西 延安 716000)

1 實驗與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠24只,體重160～200g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學實驗動物繁育中心提供。

1.1.2 主要試劑和器材 卵清白蛋白(美國Sigma公司，進口分裝，GradeII)；氫氧化鋁干粉(貴陽醫(yī)學院免疫教研室提供)；大鼠TGF-β1成套定量ELISA試劑盒(大連泛邦生物工程公司，產(chǎn)品編號：DR803647)；丹參注射液(江蘇安格藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生藥含量1.5g/ml)；吸附百日咳、白喉、破傷風聯(lián)合疫苗(由貴州省疾病防治控制中心提供，產(chǎn)品批號：2004.06.09-2)；Elx-800型酶標儀(美國Bio-TEK生產(chǎn))；402型超聲霧化器(上海合力醫(yī)療器械廠生產(chǎn))；光學顯微鏡附照相系統(tǒng)由Olympus公司生產(chǎn)；圖像采集軟件為Motic Images Advanced 3.2。

1.1.3 用藥劑量 參照中華人民共和國藥典規(guī)定人用劑量，按照實驗動物與人體表面積比等效劑量換算比率表中體表折算系數(shù)(人與大鼠用量的折算系數(shù)是56)進行換算后選擇劑量[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠支氣管哮喘氣道重塑模型的建立 參照文獻[6]方法，第1、8天以10%OVA 1ml、氫氧化鋁干粉100mg、百白破疫苗1ml腹腔注射致敏,第14天將大鼠置于自制的透明密閉霧化箱內(nèi)(60cm×40cm×30cm)給予1%的OVA(OVA300mg+NS30ml)30ml霧化吸入激發(fā), 中等霧量,每次約30min, 每天激發(fā)1次，直至大鼠出現(xiàn)明顯呼吸加深加快，口唇發(fā)紺，腹肌痙攣，點頭呼吸，站立不穩(wěn)等哮喘樣發(fā)作,共4周。

對照組57.14%的依從性，較比觀察組90.48%，偏低些；對照組85.71%的副反應(yīng)發(fā)生率，較比觀察組52.38%，偏高些，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

1.2.2 實驗分組 24只大鼠購回后飼養(yǎng)3天以適應(yīng)環(huán)境。隨機分成3組:空白對照組(簡稱空白組)以生理鹽水代替OVA腹腔注射(2ml)及霧化吸入(30min)。哮喘組第1、8天每只大鼠以10%OVA 1ml、氫氧化鋁干粉100mg、百白破疫苗1ml腹腔注射致敏，2周后給予1%的OVA溶液30ml霧化吸入激發(fā)，激發(fā)前1h腹腔注射生理鹽水2ml。丹參注射液干預組(簡稱干預組)于每次激發(fā)前1h腹腔注射丹參注射液10ml/(kg.d)，相當于生藥15g，其余均同哮喘組。以上動物均于末次激發(fā)后24h內(nèi)處死、取材并作相應(yīng)測定。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎性細胞總數(shù)及分類計數(shù) 大鼠末次激發(fā)后股動脈放血處死并開胸，分離氣管，夾閉右主支氣管,剝離左肺,用生理鹽水灌洗左肺，每次3.0ml,重復4次,回收BALF，回收率為70%以上。取灌洗液約50μl置于細胞計數(shù)板上作細胞總數(shù)計數(shù)。其余以3000r/min，離心10min，將上清液收集于無菌離心管中,置于-70℃凍存,待測TGF-β1。將離心沉渣涂片，行Wright-Giemsa染色,在油鏡下進行嗜酸粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞分類計數(shù)[7]。

1.2.4 BALF中TGF-β1濃度測定 用ELISA法測定BALF中TGF-β1的表達濃度，嚴格按試劑盒操作說明進行。在450nm 波長讀取光密度值，計算TGF-β1濃度。

1.2.5 肺組織病理組織學染色 取各組大鼠右肺中葉,經(jīng)10%福爾馬林液固定48小時后,于右肺中葉矢狀面最大局徑處橫貫取材，組織厚約3mm,常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋。將石蠟塊切成4μm厚切片,行HE染色,以備病理學觀察。

1.2.6 肺組織病理學觀察及病理學計分 光鏡下雙盲法觀察各組大鼠肺組織病理切片，參照文獻[8]的方法，將支氣管粘膜水腫、變性、壞死脫落、上皮增生等多項指標進行病理學觀察并評分，具體方法如下：以“0、2、4、6分”分別表示光鏡下“-、+、++、+++”對每個視野觀察到的肺組織進行評分，將所有分值相加即為該項得分。

1.2.7 氣道重塑指標分析 參照文獻[9]關(guān)于氣道各層的定義，采用計算機圖像分析軟件,在顯微鏡下(放大100～400倍)找到最長直徑<200μm盡量完整的氣管橫斷面(最小直徑/最大直徑>0.5，否則認為是斜切), 測量以下參數(shù)：支氣管基底膜周徑(Pbm),在小氣道，基底膜為穿過黏液腺的光滑連線，基底膜周徑內(nèi)面積即為基底膜周徑下面積(Abm)；外膜周徑(Po),外膜為氣道與肺泡相連的邊界，若氣道外膜毗鄰血管，則外膜定義為血管內(nèi)膜與氣道上皮連線的中點,外膜內(nèi)面積即是外膜周徑下面積(Ao)；平滑肌外周徑(Pmo),若平滑肌不連續(xù)，則用光滑連線連接兩側(cè)平滑肌的內(nèi)壁及外壁, 平滑肌外周徑所圍成的面積即是平滑肌外周徑下面積(Amo)；平滑肌內(nèi)周徑(Pmi),其圍成了平滑肌內(nèi)周徑下面積(Ami)。

將以上參數(shù)在測量值上進行計算：總管壁面積(WAt=Ao-Abm),氣道內(nèi)壁面積(WAi=Amo-Abm)，氣道平滑肌面積(WAm=Amo-Ami),結(jié)果均用基底膜周徑(Pbm)進行標化[10],分別用WAt/Pbm ,WAi/Pbm ,WAm/Pbm表示。

2 結(jié)果

2.1 各組BALF中炎性細胞總數(shù)及分類計數(shù)比較 哮喘組BALF中炎性細胞總數(shù)(Tot),巨噬細胞(Mon)，嗜酸細胞(Eos)，淋巴細胞,(Lym),嗜中性粒細胞(Neu)數(shù)均較空白組顯著升高，其中嗜酸性粒細胞增高最明顯(P<0.01)。干預組炎性細胞總數(shù)及細胞分類計數(shù)較哮喘組明顯下降(P<0.01),但仍高于空白組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠BALF中白細胞數(shù)及分類計數(shù)變化Table 1 Total white blood cell number and cellular composition in BALF

注：與空白組比較，①P<0.01，②P<0.05；與哮喘組比較，②P<0.01

2.2 各組大鼠BALF中TGF-β1的表達比較 空白組大鼠BALF中有微量TGF-β1表達，哮喘組BALF中TGF-β1表達濃度與空白組比較明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01) ；干預組BALF中TGF-β1濃度較哮喘組明顯下降(P<0.01), 但仍高于空白組(P<0.05)，見表2。

表2 BALF中TGF-β1濃度Table 2 Comparison of TGF-β1content in BALF

注：與空白組比較，①P<0.01,②P<0.05;與干預組，①P<0.01；

2.3 肺組織病理組織學變化及氣道重塑指標分析結(jié)果

2.3.1 肺組織病理組織學改變

2.3.1.1 空白組 空白對照組支氣管黏膜上皮完整、無纖毛變性、壞死、脫落，黏膜肌層無增厚，支氣管管腔規(guī)整，管壁及周圍僅有極少量炎性細胞浸潤，見圖1。

2.3.1.2 哮喘組 哮喘組支氣管黏膜可見部分上皮變性、壞死、脫落，平滑肌層增厚，平滑肌收縮使管腔狹窄、皺褶明顯,細支氣管和小血管的管壁增厚，其周圍可見大量嗜酸性粒細胞，淋巴細胞及少量中性粒細胞浸潤，見圖2。

2.3.1.3 干預組 干預組大鼠支氣管炎癥明顯減輕，支氣管黏膜上皮基本完整，氣道平滑肌層增厚不明顯，支氣管腔明顯增大，光整，氣管壁、肺泡隔及肺泡腔炎性細胞浸潤顯著減少，見圖3。

圖1空白對照組
Figure1Controlgroup

注：A.肺泡組織結(jié)構(gòu)正常,肺泡腔可見個別炎性細胞浸潤，支氣管壁及周圍有極少量炎性細胞滲出(HE×100); B.支氣管管腔規(guī)整,無黏膜上皮變性、壞死、脫落，支氣管平滑肌層未見明顯增厚，管壁周圍及肺泡腔可見極少量炎性細胞浸潤(HE×400); C.細支氣管管壁光滑、規(guī)整,未見黏膜上皮變性、壞死、脫落及炎性細胞浸潤(HE×1000)

圖2 哮喘組Figure 2 Asthmatic group

注：A.肺組織結(jié)構(gòu)輕度破壞,支氣管上皮變性、壞死、脫落明顯, 肺泡腔及支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤(HE×100);B.細支氣管可見部分黏膜上皮變性、壞死、脫落；管壁周圍,肺泡腔及肺泡間隔見大量炎性細胞浸潤(HE×400);C.大支氣管可見平滑肌細胞肥大、增生，平滑肌層 顯著增厚,管壁及周圍炎性細胞浸潤明顯(HE×400); D.細支氣管黏膜變性、壞死、脫落明顯,管壁及管腔周圍可見巨嗜細胞,淋巴細胞等炎性細胞浸潤(HE×1000)

圖3 干預組Figure 3 Treatment group

注：A.肺泡組織結(jié)構(gòu)基本正常,肺泡腔清晰,肺泡間隔輕度水腫、增厚,間隔及細支氣管周圍可見少量炎性細胞滲出(HE×100); B.細支氣管黏膜上皮基本完好,管腔規(guī)整,管壁周圍有少量炎性細胞浸潤(HE×400); C.較大支氣管僅見少量炎性細胞浸潤,未見氣道平滑肌層增厚(HE×400); D. 支氣管管壁光滑,未見明顯粘膜上皮變性、壞死、脫落(HE×1000)

2.3.2 肺組織病理形態(tài)學積分 肺組織病理形態(tài)學積分比較，見表3～表4。

表3 各組大鼠氣道病理形態(tài)學積分比較(分,Table 3 Comparision of rat lungs pathological scores among every group

注:與空白組比較①P<0.01,②P<0.05;與哮喘組比較，②P<0.01

2.3.3 氣道重塑指標結(jié)果 哮喘組大鼠支氣管總管壁面積(WAt/Pbm)、內(nèi)壁面積(WAi/Pbm)、平滑肌面積(WAm/ Pbm)與空白組比較均明顯增厚(P<0.01)；干預組WAt 、WAi 、WAm較哮喘組顯著減少(P<0.01)，見表5。

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 嗜酸性粒細胞數(shù)與BALF中TGF-β1濃度的相關(guān)性分析 哮喘組大鼠BALF中TGF-β1濃度與Eos數(shù)呈正相關(guān)(r=0.85，P<0.01)，見圖4。

表4各組大鼠肺組織病理學改變(n=8)

Table4Comparisionofratlungsmorphologicalparametersamongeverygroup

組別病理形態(tài)改變n-++++++空白組支氣管黏膜變性88000支氣管黏膜脫落88000管腔內(nèi)滲出86200哮喘組支氣管黏膜高精尖性80350支氣管黏膜脫落80440管腔內(nèi)滲出82420干預組支氣管黏膜變性85300支氣管黏膜脫落87100管腔內(nèi)滲出82510

表5各組大鼠氣道總管壁面積、內(nèi)壁面積及平滑肌面積厚度比較(μm2/μm)

Table5ComparisionofWAt/Pbm,WAi/PbmandWAm/Pbmamongeverygroup

組別nWAt/PbmWAi/PbmWAm/ Pbm空白組819.3±1.815.5±1.92.8±0.9哮喘組827.5±2①24.4±2.1①5.8±1.5①干預組822.6±1.6②18.8±1.4②3.8±1.5②

注：與空白組比較，①P<0.01，②P<0.05；與哮喘組比較,③P<0.01

圖4 哮喘組大鼠職Eos與TGF-β表達相關(guān)關(guān)系Figure 4 The relationship between the expression of Eos and TGF-β1

2.4.2 BALF中TGF-β1濃度與氣道平滑肌面積的相關(guān)性分析 哮喘組大鼠BALF中TGF-β1表達濃度與氣道平滑肌面積呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.01)，見圖5。

3 討論

本研究采用卵白蛋白腹腔致敏，腹腔注射免疫佐劑氫氧化鋁和白百破疫苗，2周后霧化吸入卵白蛋白進行激發(fā)的方法復制哮喘大鼠氣道重塑模型，模型制作時間為4周。哮喘組實驗動物有明顯口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)，其BALF中炎性

圖5 哮喘組大鼠BALF中TGF-β1表達與氣道平滑肌面積相關(guān)關(guān)系

Figure5TherelationshipbetweentheexpressionofTGF-β1andWam/Pbm

細胞總數(shù)、EOS、嗜中性粒細胞數(shù)明顯升高；病理切片中氣道內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，杯狀細胞增生，氣道平滑肌(ASMC)肥大增生等改變,即氣道重塑，這些改變與文獻報道相一致[11-12]，表明本實驗哮喘氣道重塑模型復制成功。

盡管目前哮喘氣道重塑的機制尚未明確，但近年大量研究表明氣道重塑是氣道炎癥產(chǎn)生氣道壁損傷后，在多種生長因子、細胞因子、炎癥介質(zhì)的參與下出現(xiàn)的不完全或過度修復。其中TGF-β1在修復過程中發(fā)揮了重要作用,也被認為是促纖維化的關(guān)鍵因子，其促進氣道平滑肌細胞和杯狀細胞肥大增生，增加膠原和纖連蛋白合成并促進氣道膠原沉積和基底膜增厚，促進結(jié)締組織蛋白合成，從而導致氣管腔狹窄、氣道重塑的形成和不可逆的肺功能改變[13-14]。因此，抑制TGF-β1的表達可減輕哮喘氣道重塑[15]。

在過敏性哮喘患者BALF中TGF-β1水平明顯升高。Minshall等[16]也通過實驗證明嗜酸性粒細胞分泌的TGF-β1mRNA能轉(zhuǎn)錄成有生物活性的蛋白質(zhì)，而且嗜酸性粒細胞是TGF-β1的主要分泌細胞。有研究表明能表達TGF-β1mRNA的細胞65%為有活性的嗜酸性粒細胞,所以可以通過減少嗜酸性粒細胞的募集而間接減少TGF-β1mRNA在肺內(nèi)的生成[17]。在我們的實驗中正常組大鼠模型BALF 中TGF-β1微量表達;哮喘組大鼠BALF中TGF-β1濃度明顯升高且與嗜酸性粒細胞數(shù)呈正相關(guān)(r=0.85，P<0.01);丹參注射液干預組大鼠BALF 中嗜酸性粒細胞數(shù)、TGF-β1濃度均較哮喘組明顯下降(P<0.05),亦提示丹參注射液可通過降低哮喘大鼠嗜酸性粒細胞數(shù)從而使TGF-β1的濃度明顯下降。

對氣道的舒張與收縮狀態(tài)進行研究發(fā)現(xiàn)，氣道在不同收縮程度下基底膜周徑(Pbm)保持不變。因此，我們利用這一特點就可以對不同個體及不同部位來源的支氣管進行比較以消除由于氣道處于不同收縮程度對測量結(jié)果的影響。本實驗中，丹參注射液干預組大鼠支氣管總管壁面積(WAt),內(nèi)壁面積(WAi)及平滑肌面積(WAm),用Pbm將測量值標化后,增加值遠不如哮喘模型組明顯,提示丹參注射液早期干預可部分抑制實驗哮喘大鼠氣道重塑改變。丹參具有降低毛細血管通透性、改善微循環(huán)、抗氧自由基等作用[18]。近年來隨著臨床應(yīng)用的深入發(fā)現(xiàn)，其對呼吸系統(tǒng)疾病也有良好的療效。丹參注射液中的有效成份主要是丹參的水溶性物質(zhì)。經(jīng)體內(nèi)外實驗證明，水溶性丹酚酸類物質(zhì)是天然有效的抗氧化劑，有的甚至優(yōu)于超氧化物歧化酶(SOD)，其中以含量最高的丹酚酸A和丹酚酸B的活性最強,對脂質(zhì)過氧化引起的生物膜損傷有明顯的保護作用[19-20]。本實驗中丹參注射液干預組大鼠BALF中炎性細胞總數(shù)、巨噬細胞(Mon) 、嗜酸性粒細胞(Eos) 、淋巴細胞,(Lym) 、嗜中性粒細胞(Neu)數(shù)及TGF-β1表達濃度均較哮喘組明顯下降 (P<0.01)，也提示丹參注射液可以顯著抑制哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的發(fā)生。因此，丹參注射液與其他抗炎治療手段的聯(lián)合干預有望成為今后抑制哮喘氣道炎癥與氣道重塑的有效治療手段，對于丹參注射液能否逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的氣道重塑尚有待于進一步深入研究。

4 結(jié)論

本實驗證明，哮喘早期給予丹參注射液干預能明顯減輕氣道炎性細胞浸潤，抑制杯狀細胞增生，ASMC增生肥大，從而預防氣道重塑產(chǎn)生，推測丹參注射液對氣道炎癥及氣道重塑抑制作用的部分機制是通過抑制EOS的產(chǎn)生及激活,從而減少TGF-β1的表達而發(fā)揮作用的。