豬腸上皮緊密連接蛋白研究進展

宗秋芳，欽偉云，霍永久，2，吳圣龍，2，包文斌，2，*

(1.揚州大學 動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009； 2.江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系良種繁育創(chuàng)新團隊，江蘇 揚州 225009)

腸道黏膜上皮屏障是抵抗腸道中病原微生物和有毒物質(zhì)入侵的第一道防線[1]。它是指腸道能夠防止某些有害物質(zhì)穿過腸黏膜進入體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能的總和[2]。正常、健康的腸道黏膜屏障由3層(黏液層、上皮糖球蛋白和表層上皮細胞)組成[3]，并具有阻礙致病性抗原入侵，把腸腔內(nèi)物質(zhì)和外界分隔開以及保持吸收營養(yǎng)能力的功能[4-5]。細胞間連接復(fù)合體作為腸道黏膜屏障的重要組成部分，主要由緊密連接(tight junction， TJ)、縫隙連接(gap junction， GJ)、黏附連接(adherence junction， AJ)和細胞橋粒(desmosome)組成[6-8]。緊密連接作為細胞間最重要的連接方式，其功能是只允許小分子可溶性物質(zhì)通過，并對毒性大分子和微生物的通行進行阻礙，這種特殊生理功能使腸道屏障的正常生理功能得以維護[9]。緊密連接最先被發(fā)現(xiàn)是由于其能通過細胞旁路途徑控制滲透作用[10]，它主要由4種跨膜蛋白(Occludin、Claudins、tricellulin和JAM)和ZOs、cingulin、AF6、7H6、rab3B、symplekin等胞質(zhì)分子以及細胞骨架結(jié)構(gòu)等共同構(gòu)成緊密連接蛋白復(fù)合物[11-12]，其“拉鏈樣”吻合結(jié)構(gòu)能對細胞間隙頂部進行有效封閉，從而阻礙毒性大分子入侵。腸道黏膜上皮屏障完整性一旦被破壞，將會導(dǎo)致多種腸道疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、慢性腹瀉及其他腸道炎癥性疾病[13-14]。作為腸道黏膜屏障中機械屏障的重要組成部分，緊密連接蛋白具有多種功能[15]，它不僅能維持上皮屏障功能、阻礙有毒大分子和微生物入侵，還能選擇性調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)和離子進入體內(nèi)[16]。此外緊密連接蛋白還參與基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖和分化狀態(tài)的調(diào)節(jié)[17]。ZO-1(zonula occludens 1)、Occludin和Claudins作為最重要的3種緊密連接蛋白，是組成腸道黏膜屏障完整性，決定腸道通透性的重要蛋白分子[18]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道屏障受損是引發(fā)仔豬腹瀉和腸道炎癥的重要內(nèi)因之一[19]，這些疾病導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟利益受損，嚴重阻礙了其發(fā)展。近期有學者發(fā)現(xiàn)，緊密連接結(jié)構(gòu)損壞可導(dǎo)致腸屏障機能障礙，而腸道屏障功能的損傷修復(fù)與緊密連接重建閉合受損的上皮細胞有關(guān)[20]，這提示緊密連接蛋白對于仔豬腸道黏膜的損傷修復(fù)十分關(guān)鍵，因此緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對于豬小腸健康的維持意義重大。本文綜述了近年來豬腸道屏障緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能的最新研究進展，歸納緊密連接蛋白基因表達情況，分析緊密連接調(diào)節(jié)機制并探尋正常生理學功能和病理特征，為豬緊密連接蛋白的后續(xù)研究以及尋找腹瀉和腸道炎癥等疾病的治療方案提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 豬主要腸道屏障緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)

1.1 ZO-1

ZO-1(zonula occludens 1)基因(GenBank登錄號：XM_021098856.1)位于豬1號染色體，由31個外顯子組成，編碼區(qū)長度為5 289 bp，編碼1 763個氨基酸。ZOs包括3個異構(gòu)體，分別是ZO-1、ZO-2和ZO-3，其中ZO-1是1986年被報道的第1個緊密連接蛋白。它是一種由1 745個氨基酸殘基構(gòu)成的分子量為220 ku的外周膜蛋白[21]，其含有3個PDZ結(jié)構(gòu)域(PDZ1～3)、1個SH3結(jié)構(gòu)域和1個GUK結(jié)構(gòu)域(ZO-1蛋白的PDZ3-SH3-GUK結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)見圖1)[22]，主要位于ZO-1的N末端，定位于連接復(fù)合物的膜下區(qū)，把多個完整的膜蛋白交聯(lián)到細胞表面，產(chǎn)生特殊的膜區(qū)域[23]，與閉鎖小帶或緊密連接的細胞質(zhì)表面相關(guān)[24]。這一結(jié)構(gòu)可連接胞質(zhì)內(nèi)Occludin蛋白的C末端，而ZO-1的末端可與肌動蛋白和應(yīng)激纖維結(jié)合。因此，Occludin和肌動蛋白骨架連接在一起組成了一個穩(wěn)定的連接系統(tǒng)[18]。

1.2 Occludin

Occludin基因位于豬(GenBank登錄號：NM_001163647.2)16號染色體，由11個外顯子組成，編碼區(qū)長度為1 569 bp，編碼523個氨基酸。其編碼的Occludin跨膜蛋白作為一種單克隆抗體的抗原最先在雞體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量為65 ku，主要集中在緊密連接纖維內(nèi)，其中小部分分布于細胞側(cè)膜[25]。它含有4個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，把蛋白分成了5個部分，分別是2個細胞外環(huán)，位于細胞質(zhì)區(qū)的N末端和C末端以及1個細胞內(nèi)環(huán)。第1個細胞外環(huán)對細胞間的黏合具有重要作用，第2個細胞外環(huán)可促使Occludin穩(wěn)定的組裝進緊密連接，N末端和C末端可以維持緊密連接的屏障功能，且C末端可與ZO-1結(jié)合維持緊密連接的完整性[26]。

圖1 ZO-1蛋白PDZ3-SH3-GUK結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Crystal structure of PDZ3-SH3-GUK domain of ZO-1 protein

1.3 Claudins

在Occludin蛋白發(fā)現(xiàn)之后不久，Claudins家族相繼被發(fā)現(xiàn)，它是一類4次跨膜蛋白。1998年Furuse等[27]首次從小鼠體內(nèi)分離出2個全長cDNA，其編碼的蛋白質(zhì)分子量約為22 ku。1999年Swisshelm等[28]又于乳腺上皮細胞中分離出人的Claudin cDNA，自此Claudins進入了人們的視野。Claudins家族包括25個成員(豬Claudins家族基因信息明確的22個成員見表1)，并且成員之間具有相同的結(jié)構(gòu)：肽鏈4次穿越細胞膜，NH2-和COOH-端位于細胞內(nèi)部，C-末端在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。其上存在結(jié)合域，體外的PDZ1結(jié)構(gòu)域可以和ZO-1、ZO-2、ZO-3及Claudin1～8序列羧基末端結(jié)合[29]。細胞外肽鏈形成2個跨膜的環(huán)，這2個環(huán)可以和鄰近其他細胞的同種類型的環(huán)相接觸，也可以和一些不明確的分子相接觸，通過同源性或異源性接觸調(diào)節(jié)細胞連接處的選擇滲透性。Claudins聚合于細胞質(zhì)膜上構(gòu)成緊密連接復(fù)合物的主鏈，并可沿著上皮細胞側(cè)面和基底細胞質(zhì)膜分布[30]，在緊密連接線中參與調(diào)節(jié)細胞黏附和連接[18]。

1.4 Cingulin、JAM、7H6和其他蛋白

Cingulin基因(GenBank登錄號：XM_013997148.2)位于豬 4號染色體，由23個外顯子組成，編碼區(qū)長度為3 591 bp，編碼1 197個氨基酸。Cingulin蛋白分子量為140 ku，于1988年發(fā)現(xiàn)定位于多種表皮組織表皮細胞的連接區(qū)。緊密連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAM)是最新發(fā)現(xiàn)的一種整合膜蛋白，為免疫球蛋白超家族成員。它能與Occludin、ZO-1、Cingulin等緊密連接蛋白結(jié)合，定位于表皮與內(nèi)皮細胞，也能分別與ZO-1和Cingulin發(fā)生共沉淀反應(yīng)[31]。7H6分子量為155 ku，通過特異性單克隆抗體鑒定其位于肝細胞和表皮細胞的緊密連接處，在內(nèi)皮細胞中也有發(fā)現(xiàn)，并且在內(nèi)皮細胞和表皮細胞中均能發(fā)揮其滲透性調(diào)節(jié)功能。Symplekin基因(GenBank登錄號：XM_005664608.3)位于豬6號染色體，由28個外顯子組成，編碼區(qū)長度為3 816 bp，編碼1 272個氨基酸。Symplekin蛋白分子量為127 ku，位于緊密連接的胞質(zhì)側(cè)[32]。緊密連接蛋白分子間的相互作用如圖2所示[33]。

表1 Claudin家族基因信息Table 1 The gene information of Claudin family

圖2 緊密連接蛋白分子間相互作用模型Fig.2 Intermolecular interaction model of tight junction proteins

2 緊密連接蛋白的功能

2.1 調(diào)節(jié)腸屏障通透性

緊密連接位于上皮細胞頂端，作為腸上皮細胞間的主要連接方式，可以維持粘膜屏障的通透性。它可以阻礙病原體和有毒物質(zhì)等進入機體，只允許離子、水和營養(yǎng)物質(zhì)進入體內(nèi)。維持腸上皮的完整性對于調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性、阻礙有毒物質(zhì)進入體內(nèi)具有重要意義[34-35]。ZO-1是緊密連接的重要組成部分，其表達量上調(diào)能夠調(diào)節(jié)腸道屏障通透性。因此，利用分子生物學手段檢測ZO-1的表達量變化對于斷奶仔豬腹瀉機理的研究具有重大意義[36]。另外，ZO-1與許多人類腸道疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系，如炎癥性腸病、乳糜性腹瀉等，此外，還有癌細胞轉(zhuǎn)移、風濕性疾病、心腦血管疾病、眼科疾病、肺系疾病、脫髓鞘性多神經(jīng)病等也都與其有關(guān)[37]。胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)作為調(diào)控腸道緊密連接蛋白基因表達的一種多肽類激素，在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中發(fā)揮著重要作用[18]。關(guān)莉莉等[38]發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射 GLP-2能使動物腸道屏障通透性顯著降低，從而有效促進動物的腸道健康。蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)能夠調(diào)節(jié)小腸上皮屏障完整性，其中活化的PKC不僅能促進ZO-1的表達，還能誘導(dǎo)跨膜蛋白Occludin的表達。研究發(fā)現(xiàn)表達于小腸上皮細胞的Toll樣受體2(Toll-like receptors，TLR-2)包含多個潛在的PKC連接位點，TLR-2能通過PKC增強與ZO-1蛋白相關(guān)的小腸上皮屏障的完整性[39]。

緊密連接蛋白Occludin的高表達可以加強腸黏膜機械屏障的穩(wěn)定性，對維持仔豬斷奶后腸黏膜通透性和阻止有害物質(zhì)入侵起著重要作用。同時，腸黏膜機械屏障的穩(wěn)定是微生物菌群平衡、免疫抗體正常分泌的前提，對仔豬抗斷奶腹瀉有重要意義[40-41]。Claudins的磷酸化程度與上皮緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)密切相關(guān)，其磷酸化失調(diào)將導(dǎo)致胃腸屏障功能受損，黏膜通透性增強[42]。Claudins還可通過調(diào)控細胞旁電荷的選擇性來調(diào)節(jié)組織滲透性[43]。由上可見，ZO-1、Occludin、Claudins作為重要的緊密連接蛋白，在調(diào)節(jié)腸屏障通透性方面起著重要作用。

2.2 維持上皮細胞極性

細胞極性這一特征在單細胞和多細胞生物中廣泛存在[44]。上皮細胞的胞間連接主要由頂端緊密連接、外側(cè)黏附連接和橋粒組成。其中緊密連接蛋白的胞外端通過相互結(jié)合將相鄰的細胞連接在一起，而胞內(nèi)端則通過ZO-1、ZO-2和ZO-3與微絲骨架相聯(lián)系[45]。很多研究表明ZO-1不僅與腸道黏膜通透性的維持密切相關(guān)，而且在上皮細胞極性的形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[46]。ZO-1能在早期和晚期MDCK細胞之間相互接觸時積累肌動蛋白結(jié)合區(qū)域(actin-binding region，ABR)，并且這種積累發(fā)生在細胞之間相互接觸啟動之前，發(fā)生于細胞游離緣的尖端[47]。Cadherin在不同類型的細胞中與肌動蛋白絲有密切的空間關(guān)系，形成細胞到細胞的黏合結(jié)。Claudin-7蛋白作為組成細胞之間緊密連接的重要蛋白分子，在細胞極性的維持以及緊密連接腸道屏障功能的發(fā)揮中起著重要作用[36]。Webb等[48]發(fā)現(xiàn)，Claudin異常表達可使組織滲透屏障遭到損壞，使細胞的極性完全消失，細胞與細胞間的黏附能力減小，從而導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。也有研究表明：ZO-1可以與肌動蛋白微絲連接，參與細胞骨架的構(gòu)成[49]。

2.3 其他作用

緊密連接蛋白ZO-1作為緊密連接的重要組成蛋白之一，在緊密連接蛋白的形成及與細胞骨架系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮著重要作用。ZO-1不僅參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和維持上皮細胞極性，間接參與形成細胞骨架，而且在細胞增殖分化、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)錄等方面也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[36]。血管活性腸肽能神經(jīng)通路對腸上皮細胞屏障通透性和ZO-1的表達量具有調(diào)節(jié)作用[50]。ZO-1可以在細胞膜和細胞核之間相互移行，因此它可能在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用[51]。也有研究表明，在人類結(jié)腸癌中緊密連接蛋白的表達變化與上皮樣組織裂解密切相關(guān)[52]。

緊密連接是血腦屏障的重要組成部分(圖3)，在血腦屏障通透性調(diào)節(jié)方面起著決定性作用[53]。Wolburg等[54]通過研究自身免疫性腦脊髓炎以及人類成膠質(zhì)細胞瘤的腦和脊髓，發(fā)現(xiàn)被炎性物質(zhì)包繞的小靜脈上緊密連接失去了Claudin-3的免疫著色，而其他緊密連接蛋白著色并未發(fā)生改變，推斷Claudin-3是決定體內(nèi)血腦屏障緊密連接的主要成分。Siljamaki等[50]發(fā)現(xiàn)，p38δ有絲分裂原活化蛋白激酶的功能被siRNA或腺病毒介導(dǎo)的顯性負突變體抑制，會導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞中ZO-1蛋白水平的顯著降低，而其他連接蛋白的表達并沒有改變。這表明只有ZO-1被p38δ調(diào)控，其原因為ZO-1是功能性緊密連接的一個重要組成部分，p38δ參與的各種病理過程也可能干擾上皮成熟和緊密連接的構(gòu)造和功能。Claudins家族編碼的蛋白在正常組織中的表達和在腫瘤中的表達存在差異，利用Claudins表達的高度組織特異性，有望將其作為多種腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的標志。Claudin-5可以促進基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的激活，進而促進血管發(fā)生并且提高血管的通透性[55]。啟動子甲基化可導(dǎo)致Claudin-7基因沉默，并且Claudin-7低表達有可能在結(jié)直腸腫瘤的進展過程中發(fā)揮重要作用[36]。

資料來源于HAWKINS B T and DAVIS T P (2005)[56]。The figure comes from HAWKINS B T and DAVIS T P (2005)[56].

3 豬緊密連接蛋白的表達調(diào)控

γ-干擾素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)可通過影響ZO-1和Occludin的表達量而降低腸上皮的屏障功能[57]。劉海萍等[58]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬在早期斷奶后腸道通透性增加，腸道屏障功能受到損壞，原因可能是小腸上皮細胞上緊密連接蛋白Occludin mRNA表達降低。通過建立斷奶仔豬腹瀉模型，用HE染色法、免疫組化和RT-PCR法檢測Claudin-1在不同腹瀉時期的胃腸道表達變化，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬炎癥程度隨著時間延長逐漸加重；從而推斷斷奶腹瀉仔豬腸道Claudin-1表達水平下調(diào)可能與炎性細胞因子的調(diào)控有一定關(guān)系，因此Claudin-1表達水平下調(diào)可以作為評價腸道黏膜屏障功能是否發(fā)生障礙的重要指標[59]。

胰高血糖素樣肽-2可促進斷奶仔豬空腸上皮緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的基因表達，并改善其在組織中的分布[60]。可利用營養(yǎng)手段提高腸道ZO-1和Occludin mRNA基因及其蛋白質(zhì)的表達，可增強其腸道屏障功能[61]。據(jù)報道，民豬仔豬斷奶前腸道緊密連接蛋白mRNA的高水平表達，可以減少腹瀉發(fā)生，從而促進腸道健康。仔豬開始發(fā)生腹瀉時，由腹瀉產(chǎn)生的一些炎癥因子會抑制緊密連接蛋白的表達[59，62-63]，但隨著腹瀉時間的延長，機體會上調(diào)緊密連接蛋白的表達，降低腸道通透性，使腸道黏膜功能逐漸穩(wěn)定，實現(xiàn)腹瀉的康復(fù)[64-66]。所以，研究斷奶前后仔豬緊密連接蛋白mRNA的表達對于仔豬抗斷奶腹瀉具有重要意義[67]。王改[68]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過上調(diào)Occludin和ZO-1表達來改善H2O2介導(dǎo)的緊密連接和腸黏膜屏障功能受損程度，表明姜黃素可促進細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成，降低仔豬腸道黏膜通透性，進而增強腸黏膜機械屏障功能[69]。鋅對于維持腸道黏膜屏障的完整性具有重要意義，攝入高劑量氧化鋅會導(dǎo)致動物胃腸道食糜中鋅含量增加，降低斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生率[70-71]，而豬體內(nèi)鋅含量缺乏會引起腸道被大腸埃希菌感染[72]。深入研究發(fā)現(xiàn)，仔豬在斷奶后腸黏膜通透性會增加，腸上皮緊密連接蛋白表達量下降(Occludin和ZO-1 mRNA豐度以及ZO-1的表達量降低)；而添加高劑量氧化鋅可抑制腸道黏膜上細菌的黏附，使上皮細胞滲透性降低，提高Occludin和ZO-1基因表達量，保護腸道黏膜屏障功能，減弱早期斷奶應(yīng)激對仔豬腸道黏膜屏障的損傷[73]。此外，丙氨酰-谷氨酰胺二肽(alanyl-glutamine，Ala-Gln)可以增加IPEC-1細胞緊密連接蛋白Occludin的表達，促進小腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成[74]。小腸上皮細胞被侵襲性大腸埃希菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)感染后，其緊密連接結(jié)構(gòu)受損，相關(guān)蛋白的表達也減少，而乳酸菌處理可使這種受損程度減輕，相關(guān)蛋白表達量增多?？梢酝茰y乳酸菌黏附于腸上皮細胞Caco-2后，可抑制侵襲性大腸埃希菌對單層細胞的完整性的破壞，從而改善緊密連接結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白的表達分布[75]。

4 結(jié)論

腸道黏膜屏障不僅可以抵御微生物的侵襲，還決定著機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的效率。腸道黏膜屏障破壞可以造成多種動物發(fā)生腸道疾病，嚴重影響了畜禽業(yè)的發(fā)展。腸道黏膜組織作為病原微生物感染豬的主要途徑，維護其黏膜屏障的完整性對于豬的腸道健康起著關(guān)鍵作用。緊密連接蛋白是腸道黏膜屏障中機械屏障的重要組成部分，但是目前對豬腸道緊密連接相關(guān)蛋白的研究仍不成系統(tǒng)。ZO-1、Occludin和Claudins蛋白作為緊密連接重要的結(jié)構(gòu)蛋白，研究其結(jié)構(gòu)、功能以及基因的表達有利于進一步了解緊密連接蛋白對豬腸道屏障的影響，為后續(xù)的疾病防控提供依據(jù)。