沖泡條件對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)及抗氧化能力的影響

張程程，李小瓊，鄭美瑜，劉大群

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

明日葉(Angelicakeiskei)屬傘形科(Umbelliferae)耐寒多年生草本植物，原產(chǎn)于日本八丈島，因具有“藥食同源”之功效，深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?。明日葉不僅含有人體必需的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，而且富含植物活性物質(zhì)，包括查爾酮、類黃酮、香豆素、倍半萜烯、雙烯、三烯、炔醇類等化合物，在抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、降血脂、降血糖等方面具有突出作用[1-2]。黃酮和多酚是明日葉內(nèi)最主要的活性抗氧化物質(zhì)[3-4]。查爾酮屬于黃酮類化合物，是明日葉的主要功能性成分物質(zhì)，研究表明，從明日葉中分離得到的查爾酮能清除過(guò)氧化物，具有抗氧化作用[5-6]。

明日葉莖、葉除可作為天然健康蔬菜直接食用外，還可作茶飲，或制作功能飲料。研究表明，以明日葉為原料，添加纖維素酶輔助發(fā)酵制作明日葉發(fā)酵茶，不僅能夠有效去除明日葉本身的澀味，還能增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶出，是一種高品質(zhì)的茶飲[7]。然而，不同種類茶的最佳沖泡溫度和時(shí)間有明顯差別：未經(jīng)發(fā)酵的綠茶用80 ℃溫水沖泡可使其茶多酚、氨基酸及咖啡因等物質(zhì)得到最大保存，而后發(fā)酵茶普洱茶的最佳沖泡溫度為100 ℃，全發(fā)酵茶紅茶在93 ℃下沖泡茶多酚溶出量最大[8-10]。在本研究檢索范圍內(nèi)，還未見不同沖泡溫度和時(shí)間對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量影響的相關(guān)報(bào)道。為此，以明日葉發(fā)酵茶為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同沖泡條件下茶湯中活性物質(zhì)的溶出量，并在此基礎(chǔ)上對(duì)茶湯的抗氧化活性進(jìn)行分析，為優(yōu)化明日葉發(fā)酵茶的沖泡方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

明日葉發(fā)酵茶制備[7]：取新鮮明日葉的嫩葉部分為原料，經(jīng)過(guò)清洗、攤晾萎凋、溫水漂燙、瀝干、攤涼、分切、熱烘(60 ℃，10 min)、揉捻(加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的纖維素酶)、發(fā)酵(36 ℃，4～8 h)、熱烘(100～110 ℃，10 min)、攤涼、篩分等步驟制作而成。

1.2 主要試劑及儀器

Folin-Ciocalteu試劑，DPPH(1，1-二苯基-2-硝基苦肼)，ABTS[2 ，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]，TPTZ(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，Trolox(6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸，亦稱水溶性維生素E)，美國(guó)Sigma公司；沒食子酸(GAE)，阿拉丁試劑；蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

TP-214電子天平，美國(guó)Denver公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取明日葉發(fā)酵茶1 g于250 mL玻璃燒杯中，分別加入50 mL 80、85、90、95 ℃的蒸餾水，浸泡10 min，取茶湯過(guò)0.22 μm水性濾膜，收集濾液用于總黃酮、總多酚、總查爾酮及抗氧化體系DPPH、ABTS、FRAP(亞鐵還原能力)測(cè)定。

另稱取明日葉發(fā)酵茶1 g于250 mL玻璃燒杯中，加入50 mL 90 ℃的蒸餾水，分別浸泡5、10、15、20、30 min，取茶湯過(guò)0.22 μm水性濾膜，收集濾液用于總黃酮、總多酚、總查爾酮及抗氧化體系DPPH、ABTS、FRAP測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 明日葉發(fā)酵茶主要活性物質(zhì)含量測(cè)定

總酚酸含量采用FC酚法(Folin-Ciocalteu法)測(cè)定[11]，以GAE為標(biāo)準(zhǔn)品定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測(cè)定[12]，以Rutin為標(biāo)準(zhǔn)品定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總查爾酮含量采用分光光度法測(cè)定，以查爾酮為標(biāo)準(zhǔn)品，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍得到紫外光譜圖，確定其最大吸收波長(zhǎng)為308 nm，在308 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以查爾酮為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 明日葉發(fā)酵茶抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除作用測(cè)定。參照彭長(zhǎng)連等[13]的方法，略有改變。取0.1 mL發(fā)酵茶提取液，加入3.9 mL 0.1 mmol·L-1DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min后，以溶劑為空白，于517 nm處測(cè)吸光值。以Trolox為參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ABTS自由基清除作用測(cè)定。參照韓光亮等[14]的方法，略有改變。將50 mL的ABTS(7 mmol·L-1)溶液與880 μL過(guò)硫酸鉀溶液(140 mmol·L-1)混合，避光過(guò)夜反應(yīng)12～16 h。以ABTS+自由基為貯備液，測(cè)定時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋至734 nm處吸光值為0.70±0.02的反應(yīng)液。取0.1 mL發(fā)酵茶提取液，加入3.9 mL ABTS工作液，避光靜置反應(yīng)6 min后，以無(wú)水乙醇為空白，于734 nm處比色。以Trolox為參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

FRAP還原能力測(cè)定。根據(jù)Benzie等[15]所述方法測(cè)定明日葉發(fā)酵茶的FRAP還原能力。將300 mmol·L-1醋酸緩沖液(pH 3.6)、10 mmol·L-1TPTZ(溶于40 mmol·L-1HCL)及20 mmol·L-1FeCl3按10∶1∶1的體積比配成FRAP反應(yīng)液。取0.15 mL發(fā)酵茶提取液，加入2.85 mL FRAP試劑，反應(yīng)10 min后，于593 nm處比色，以水為空白對(duì)照，以Trolox為參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各處理均設(shè)3次重復(fù)。所有數(shù)據(jù)在Excel 2010上進(jìn)行整理，在SAS 9.1平臺(tái)上進(jìn)行方差分析和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沖泡溫度對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量的影響

如圖1所示，隨著沖泡溫度增加，茶湯中總酚、總黃酮和總查爾酮溶出量變化趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。沖泡溫度在85 ℃以下，明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量隨著溫度的升高明顯增加，當(dāng)沖泡溫度為90 ℃時(shí)，明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量達(dá)到最大值，之后隨沖泡溫度增加活性物質(zhì)含量反而下降。趙寧等[16]研究了單因素沖泡水溫對(duì)紫陽(yáng)茶有效成分含量的影響，結(jié)果表明，沖泡溫度為80 ℃時(shí)，茶多酚溶出量達(dá)最大值。這是由于溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)越活躍，越有利于茶葉中活性物質(zhì)的浸出，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多酚氧化或蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象，阻礙活性物質(zhì)的溶出。

圖1 沖泡溫度對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量的影響Fig.1 Effect of brewing temperature on polyphenol， flavonoid and chalcone contents of Angelica keiskei tea

2.2 沖泡時(shí)間對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量的影響

如圖2所示，明日葉發(fā)酵茶中總酚和總黃酮溶出量隨著沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且總酚和總黃酮溶出量在15 min內(nèi)迅速增加，之后進(jìn)入飽和狀態(tài)。隨著沖泡時(shí)間延長(zhǎng)，茶湯中查爾酮的溶出量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且在20 min時(shí)達(dá)到最大值。一般來(lái)說(shuō)，發(fā)酵茶的滋味隨著沖泡時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增濃，活性物質(zhì)溶出量逐漸增大，但沖泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，茶湯中的查爾酮因與空氣長(zhǎng)期接觸而氧化，故20 min后查爾酮濃度呈下降趨勢(shì)。

圖2 沖泡時(shí)間對(duì)明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)溶出量的影響Fig.2 Effect of brewing time on polyphenol， flavonoid and chalcone contents of Angelica keiskei tea

2.3 沖泡溫度對(duì)明日葉發(fā)酵茶抗氧化活性的影響

采用3種抗氧化體系考查沖泡溫度對(duì)明日葉發(fā)酵茶抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖3所示。在不同的沖泡溫度下， DPPH、ABTS自由基清除力及FRAP還原力的變化趨勢(shì)基本一致，當(dāng)沖泡溫度在90 ℃以下時(shí)，茶湯的抗氧化活性隨著沖泡溫度的升高而顯著(P<0.05)增加，但當(dāng)沖泡溫度為95 ℃和90 ℃時(shí)，兩種條件下茶湯的抗氧化活性無(wú)顯著差異。

柱上無(wú)相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.

2.4 沖泡時(shí)間對(duì)明日葉發(fā)酵茶抗氧化活性的影響

如圖4所示，3種抗氧化體系的結(jié)果均表明，茶湯的抗氧化活性隨著沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著(P<0.05)增加。與茶湯中總酚、總黃酮含量變化不同的是，沖泡15 min后茶湯的抗氧化活性并未進(jìn)入飽和狀態(tài)，而是繼續(xù)隨著沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。這可能是因?yàn)?，雖然沖泡20 min時(shí)黃酮、多酚的浸出量都已進(jìn)入飽和，但明日葉中還含有香豆素、倍半萜、維生素C等亦能發(fā)揮抗氧化作用[2, 17-18]的成分，這些物質(zhì)的不斷溶化，使得茶湯的抗氧化能力隨著沖泡時(shí)間延長(zhǎng)而繼續(xù)增強(qiáng)。這一假設(shè)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.5 明日葉發(fā)酵茶活性物質(zhì)含量與抗氧化性的相關(guān)性分析

如表1所示， DPPH自由基清除率與明日葉活性物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，且總酚、總黃酮、總查爾酮與DPPH自由基清除能力具有較ABTS和FRAP更高的相關(guān)系數(shù)?？偡?、總黃酮、總查爾酮與3種抗氧化體系測(cè)定的抗氧化性的相關(guān)性大小均表現(xiàn)為總黃酮>總酚>總查爾酮，且總黃酮與DPPH、ABTS、FRAP抗氧化性的相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說(shuō)明明日葉發(fā)酵茶的抗氧化活性與其中的黃酮具有顯著的相關(guān)性。

2.6 明日葉活性物質(zhì)含量及抗氧化活性的主成分分析

為進(jìn)一步分析不同沖泡條件對(duì)明日葉發(fā)酵茶中活性物質(zhì)和抗氧化能力的影響，對(duì)不同樣品總酚、總黃酮、總查爾酮、DPPH法、ABTS法和FRAP法測(cè)定的抗氧化性進(jìn)行主成分分析。如圖5所示，第一主成分和第二主成分分別可以解釋82.39%和14.98%的變化。結(jié)果顯示，沖泡溫度90 ℃及以上的樣品聚在一起，與沖泡溫度90 ℃以下的樣品有明顯差異，表明溫度對(duì)茶湯的活性物質(zhì)含量和抗氧化能力具有明顯影響。沖泡時(shí)間在10～20 min范圍內(nèi)的樣品可以較好地聚在一起，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品間差異逐漸增大。此外，第一主成分與總酚、總黃酮、總查爾酮含量，以及DPPH法、ABTS法和FRAP法測(cè)定的抗氧化性均具有負(fù)相關(guān)性，而第二主成分與總酚、總黃酮、總查爾酮含量，以及DPPH法測(cè)定的抗氧化性具有正相關(guān)性，與ABTS法和FRAP法測(cè)定的抗氧化性具有負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明ABTS法和FRAP法測(cè)定的抗氧化性和其他測(cè)定量不相關(guān)，這與相關(guān)性分析的結(jié)果一致。

圖4 沖泡時(shí)間對(duì)明日葉發(fā)酵茶抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of brewing time on antioxidant activities of Angelica keiskei tea

TPC，總酚；TFC，總黃酮；TCC，總查爾酮。TPC， Total phenolic; TFC， Total flavonoid; TCC， Total chalcone.

表1 明日葉活性物質(zhì)含量與抗氧化性的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient within phenolics， flavonoid， chalcone content and antioxidant activities of Angelica keiskei tea

3 結(jié)論

從生活角度出發(fā)，以沖泡溫度、沖泡時(shí)間為主要因素，對(duì)明日葉發(fā)酵茶茶湯中活性物質(zhì)溶出量進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上測(cè)定茶湯的抗氧化活性，分析茶湯抗氧化活性與活性物質(zhì)浸出量的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沖泡水溫過(guò)低，活性物質(zhì)溶出量較少，水溫過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)多酚氧化或阻礙溶出等現(xiàn)象，不利于發(fā)酵茶活性物質(zhì)的溶出，綜合考慮，建議明日葉發(fā)酵茶的沖泡溫度為90 ℃。當(dāng)沖泡時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，茶湯中多酚、黃酮和查爾酮溶出量在15 min內(nèi)快速增加，之后進(jìn)入飽和狀態(tài)，因此沖泡時(shí)間以15～20 min為宜。相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果表明，DPPH法測(cè)定的抗氧化性與茶湯中的總酚、總黃酮、總查爾酮含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，3種活性物質(zhì)與抗氧化性的相關(guān)性大小為總黃酮>總酚>總查爾酮。