青海省馬鈴薯黑脛病病原菌的鑒定

王 信，程 亮，王亞藝，高旭升，李松齡

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院/省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是世界第四大糧食作物，在中國各地均有種植[1-2]。馬鈴薯黑脛病(potato blackleg)屬細(xì)菌性病害，近年來在我國東北、西北、華北和西南馬鈴薯主產(chǎn)地區(qū)均有不同程度的發(fā)生[3]。該病菌主要侵染維管束組織，可侵染馬鈴薯的莖和塊莖，從種薯發(fā)芽到生長后期均可發(fā)病，以苗期最盛。馬鈴薯是青海省的主要糧食作物之一，是調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中重點(diǎn)發(fā)展的十大產(chǎn)業(yè)之一，是當(dāng)?shù)刈罹呤袌龈偁幜Φ膬?yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品之一，是青海省淺山、腦山地區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源。2013年青海省馬鈴薯種植面積達(dá)到9.56萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)到2 150萬t，僅次于小麥、油料，成為第三大作物；但黑脛病造成馬鈴薯爛種死苗，品質(zhì)、產(chǎn)量大幅降低，已成為制約青海省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

目前，已報(bào)道的引起馬鈴薯黑脛病的病原菌有Dickeyaspp. (syn.Erwiniachrysanthemi或Pectobacteriumchrysanthemi)[4-6]、P.atrosepticum(syn.E.carotovorasubsp.atroseptica) (Pa)[7]、P.carotovorumsubsp.carotovorum(syn.E.carotovorasubsp.carotovora) (Pcc)[8]和P.carotovorum. subsp.brasiliensis(Pcb)[9]。多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為，P.atrosepticum是引起溫帶地區(qū)馬鈴薯黑脛病的主要致病菌，而Dickeyaspp.則是熱帶亞熱帶馬鈴薯黑脛病的主要病原[10]。雖然已證實(shí)Pcc可以感染馬鈴薯塊莖，引起黑脛癥狀，但該亞種卻是引起溫帶地區(qū)馬鈴薯黑脛病的次要病原菌[8]。迄今為止，僅僅在亞熱帶地區(qū)感染的馬鈴薯黑脛病樣中發(fā)現(xiàn)Pcb[9]；在北美和西歐，馬鈴薯黑脛病的主要致病菌依然為Pa，Pa也是我國部分地區(qū)馬鈴薯黑脛病的主要病原[11-12]。青海地區(qū)馬鈴薯黑脛病致病菌鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從青海地區(qū)大通縣、湟中縣、湟源縣、樂都縣和民和縣等馬鈴薯生產(chǎn)地病樣組織中分離病原菌，通過形態(tài)特征、生理生化和致病性以及16S rRNA序列分析進(jìn)行病原菌鑒定，同時(shí)比較分析不同菌株的致病力，以期為馬鈴薯黑脛病的早期診斷和防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及培養(yǎng)基

2016年6—8月，在青海省的大通縣、湟中縣、湟源縣、樂都縣和民和縣的馬鈴薯生產(chǎn)田采集馬鈴薯黑脛病病樣。

結(jié)晶紫果膠酸鹽選擇性培養(yǎng)基(CVP)：在500 mL沸騰的蒸餾水中依次加入1 mL 0.75 g·L-1結(jié)晶紫溶液、1 mol·L-1NaOH溶液4.5 mL、100 g·L-1CaCl2·2H2O溶液3 mL(新鮮溶液)、3.0 g瓊脂粉、1.0 g NaNO3、9.0 g聚果膠酸鈉，待聚果膠酸鈉加入時(shí)人工攪拌30 s，然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂粉15 g，用去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.2 病原菌分離

在超凈工作臺中，稱取0.1 g病塊莖置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL滅菌蒸餾水，放入玻璃珠充分打散混合，置于120 r·min-1搖床培養(yǎng)30 min后，充分搖勻。用無菌水將菌懸液依次稀釋成10-2～10-7的稀釋液，每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別涂布到CVP培養(yǎng)基上。25～27 ℃黑暗培養(yǎng)48 h，將典型形態(tài)的菌落在CVP培養(yǎng)基反復(fù)劃線，進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行編號和保存。

1.3 致病力測定

將保存的5個(gè)菌株在LB培養(yǎng)基上活化，配成5×108cfu·mL-1菌懸液。選取生長6周的馬鈴薯植株(品種為大西洋)，采用針刺法接種。用滅菌牙簽醮取菌懸液插入從基部數(shù)第3個(gè)葉腋，接種部位用凡士林涂抹保濕。每個(gè)菌株接種10株馬鈴薯。相對濕度100%，保濕24 h后，置于大棚中。棚內(nèi)晝夜溫度16～21 ℃，濕度65%～85%。接種72 h后測量病斑的長度，取平均值作為病斑平均長度；同時(shí)，從發(fā)病植株分離病原菌進(jìn)行觀察鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)[13]的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄：病斑長度1～5 mm為弱致病力菌株，5.1～10 mm為中等致病力菌株，10 mm以上為強(qiáng)致病力菌株。

1.4 菌株形態(tài)和生物化學(xué)特性分析

菌株的菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、檸檬酸鹽分解和37 ℃生長測定參考《植病研究方法》[14]。病原菌對蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用測定參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[15]和《植病研究方法》[14]。以本實(shí)驗(yàn)室保存的黑脛病致病菌Pa(編號Pa11)為對照菌株。

1.5 16S rRNA的擴(kuò)增和序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取

使用Ezup柱式SK8255試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取馬鈴薯黑脛病病菌的DNA。取1 μL DNA溶液用1.5%(體積質(zhì)量)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 16S rRNA片段的擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物(27f: 5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′；1942r: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL: 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL(編號為KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng·L-1)1μL，引物27f和1942r (20 μmol·L-1)各1 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min?；厥沾笮〖s1.5 kb的PCR產(chǎn)物，將其連接到pGEMT-Easy載體(Promega corp.，美國)，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切和PCR鑒定后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序結(jié)果用軟件Chromas(ver. 2.4.1)進(jìn)行序列修正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本文所測株系序列分別進(jìn)行序列比對。利用軟件MEGA(ver. 5.05)的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度自舉檢測(bootstrap)1 000次。

1.6 Pa特異引物擴(kuò)增基因

用Pa特異性引物Eca1f (5′-CGGCATCATAAAAACACG-3′)和Eca1r (5′-GCACACTTCATCCAGCGA-3′)[16]擴(kuò)增5個(gè)分離菌株。PCR反應(yīng)體系25 μL∶DNA模板1 μL(100 ng·L-1)，2×TaqPCR Master Mix 12 μL，上游引物1 μL(20 μmol·L-1)，下游引物1 μL(20 μmol·L-1)，加ddH2O至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以2 000 bp DNA Marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%(體積質(zhì)量)瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色觀察是否有特異性帶產(chǎn)生。選用青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室保存的果膠桿菌致病菌Pa(Pa11)為對照株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑脛病病原菌的形態(tài)及理化特征

從馬鈴薯黑脛病病樣中共分離出5個(gè)菌株，命名為QDM-3、QMX-6、QDM-1、QHQ-4和QHL-7。5個(gè)菌株在CVP培養(yǎng)基上均向培養(yǎng)基內(nèi)部擴(kuò)展，形成杯狀凹陷(圖1-A)。將分離的菌株分別回接4～6葉期健康的馬鈴薯植株，接種24 h后，植株莖基部即開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)；隨著接種時(shí)間的延長，病株癥狀逐漸加重(圖1-B)；接種72 h后病株莖基部完全變色，植株倒伏，與田間黑脛病癥狀表現(xiàn)一致。

與對照菌株P(guān)a一樣，5個(gè)菌株在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈灰白色、不透明、圓形中間突起，革蘭氏染色陰性，不能在37 ℃生長，不能使明膠液化，具有耐鹽性(5% NaCl)，對紅霉素不敏感；過氧化氫酶和蔗糖還原試驗(yàn)反應(yīng)均為陽性；可以利用檸檬酸鹽；氧化酶、吲哚產(chǎn)生和磷酸酶活性試驗(yàn)均為陰性；可利用乳糖、D-麥芽糖、棉籽糖、纖維二糖、蜜二糖和α-甲基葡萄糖產(chǎn)酸，不能利用山梨醇和D-阿拉伯糖(表1)。測定結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道的黑腐果膠桿菌(P.atrosepticum)的性狀相符合[12]。

2.2 16S rRNA的序列分析

PCR擴(kuò)增5個(gè)菌株的16S rRNA，均得到一條大小約為1.5 kb的產(chǎn)物(圖2)。序列比對結(jié)果表明，5個(gè)菌株與已報(bào)道的Pa的16S rRNA序列的同源性均達(dá)100%?；?6S rRNA基因完整序列，以Dickeyaaquaticastrain 174/2菌株(NCBI Reference Sequence: NR_134020.1)為外群，將5個(gè)菌株和對照菌株(Pa11)的序列與已發(fā)表的22株果膠桿菌菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖3)顯示，本研究分離得到的5個(gè)菌株與Pa菌株構(gòu)成了明顯的分枝，已發(fā)表的Pcb、Pw、Pb與Pcc株系形成的類群則分別構(gòu)成了獨(dú)立的分枝。

圖1 病原菌在CVP培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生杯狀凹陷(A)和接種60 h后莖基部癥狀(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased stem of potato on CVP agar (A) and symptom of healthy stem at 60 h after inoculation with the pathogen (B)

表1 從田間馬鈴薯莖基部分離的5個(gè)菌株的生理生化特性Table 1 Physiochemical characteristics of 5 strains isolated from diseased tubers of potato plants in field

2.3 Pa特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

用Pa特異性引物Eca1f和Eca1r擴(kuò)增5個(gè)菌株及對照菌株(Pa11)。結(jié)果表明，5個(gè)菌株均擴(kuò)增得到一條大小約690 bp的特異條帶(圖4)，在對照菌株P(guān)a11中也得到該擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)一步證實(shí)分離的5個(gè)菌株均為Pectobacteriumatrosepticum。

2.4 病原菌的致病力

用病原菌接種生長6周的馬鈴薯植株，接種72 h后統(tǒng)計(jì)病斑長度，將病斑長度作為致病力強(qiáng)弱的測定指標(biāo)。結(jié)果表明：5個(gè)菌株的致病力有差異，致病力水平介于中等和強(qiáng)致病力之間；其中，菌株QLM-4、QHL-7、QDM-3在接種72 h后表現(xiàn)強(qiáng)致病力，菌株QMX-6和QHQ-4表現(xiàn)為中等致病力(表2)。

M，DL 2 000 DNA Marker；1，陽性對照(Pa11)；2，QLM-4；3，QHL-7；4，QHQ-4；5，QMX-6；6，QDM-3；7，陰性對照(無菌水)。M， DNA marker DL 2 000; Lane 1， Positive control Pa11; Lane 2， 3， 4， 5 and 6 represented QLM-4， QHL-7， QHQ-4， QMX-6 and QDM-3， respectively; Lane 7， Sterile water was used as negative control.

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯黑脛病是馬鈴薯生產(chǎn)上重要病害之一，近年來青海不斷擴(kuò)大馬鈴薯生產(chǎn)規(guī)模，黑脛病在青海省發(fā)生范圍也在蔓延擴(kuò)大。本研究分離純化了青海省馬鈴薯黑脛病的病原菌，通過形態(tài)觀察、致病性測定及16S rRNA序列比較，明確此病原菌為黑腐果膠桿菌(Pectobacteriumatrosepticum)。進(jìn)一步測定該病原菌的生理生化特征，包括過氧化氫酶、氧化酶產(chǎn)生，明膠液化，蔗糖還原，磷酸酶活性，吲哚產(chǎn)物，對紅霉素的敏感性，碳水化合物產(chǎn)酸，有機(jī)鹽產(chǎn)酸，37 ℃生長及5% NaCl溶液中的生長情況。結(jié)果表明，本研究分離的5個(gè)菌株與對照菌株P(guān)a11均不能在37 ℃生長，可以在5% NaCl培養(yǎng)基正常生長，能降解檸檬酸，這與已發(fā)表的Pa菌株表現(xiàn)一致。因此，確定本研究分離的5個(gè)菌株均屬于Pa種[7，17-18]。

馬鈴薯黑脛病在廣州、廣西、黑龍江、甘肅、內(nèi)蒙古馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。王旭等[11]報(bào)道內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯黑脛病的病原為Pa，佘小漫等[12]在廣東省廣州市、惠州市、江門市馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯黑脛病樣中分離的病原菌也主要是Pa。青海省馬鈴薯主要種植區(qū)在青海東部農(nóng)業(yè)區(qū)的干旱和半干旱地區(qū)，東起民和縣西至日月山，跨越河湟兩大灌區(qū)的溝壑丘陵以及海北大通河畔農(nóng)牧交錯(cuò)小塊旱作區(qū)，海拔1 850～3 100 m，縱垂溫暖、涼溫、冷溫3個(gè)農(nóng)業(yè)氣候帶。本研究從青海溫暖帶氣候的樂都縣和民和縣、涼溫氣候帶的大通縣和湟中縣以及冷溫氣候帶的湟源縣分別采集的馬鈴薯黑脛病病樣中分離的菌株也是Pa。這與前人的研究結(jié)果基本一致。

支點(diǎn)上的數(shù)字為Bootstrap生成的百分率。條形圖表示遺傳距離。The number at each branch points showed percentage supported by bootstrap. Bar indicated the genetic distance of evolutionary branches.

M， DL2 000 DNA Marker； 1， 陽性對照(Pa11)； 2， QLM-4； 3, QHQ-4； 4, QHL-7； 5, QMX-6； 6, QDM-3； 7, 陰性對照(無菌水)。M， DNA marker DL 2 000; Lane 1， Positive control Pa11; Lane 2， 3， 5， and 6 represented QLM-4， QHQ-4， QHL-7， QMX-6 and QDM-3; Lane 7， Sterile water was used as negative control.

近幾年，隨著Pectobacteriumsp.屬的種和亞種數(shù)量逐漸增加，傳統(tǒng)的微生物學(xué)鑒定方法受到了越來越多的挑戰(zhàn)。P.atrosepticum和P.carotovorum是2個(gè)引起植物黑脛病的最常見的種，通過37 ℃條件下生長、α-甲基葡萄糖產(chǎn)酸和蔗糖還原試驗(yàn)很容易區(qū)分這2個(gè)種。隨著P.betavasculorum，P.wasabiae，P.carotovorumsubsp.brasiliensis和P.carotovorumsubsp.odoriferum這些種和亞種的確認(rèn)，單單依靠表型特征和生理生化測試進(jìn)行相同種或亞種之間的準(zhǔn)確鑒別變得比較困難。DNA標(biāo)記、血清學(xué)和DNA雜交在許多植物病原細(xì)菌致病亞種和致病型區(qū)分方面有較多報(bào)道，其中16S rRNA序列分析和PCR特異性擴(kuò)增方法是目前較常用的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類方法[19]。16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，本研究分離的5個(gè)Pa菌株與已發(fā)表的Pa株系共同形成了明顯的Pa分枝，且該分枝與其他種(或亞種)形成了不同類群。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出種(Pa、Pw和Pb)與亞種(Pcc和Pcb)之間形成了明顯不同的類群，利用Pa特異性引物在Pa株系和對照菌株P(guān)a11中均能擴(kuò)增得到大約690 bp的Pa特異條帶，也證明本實(shí)驗(yàn)中引起青海省馬鈴薯黑脛病的病原菌為黑腐果膠桿菌。

表2 5個(gè)Pa菌株的采集地點(diǎn)及致病力等級Table 2 Sampling sites and pathogencity level of the 5 Pa strain collections