復(fù)方苦玄參顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

徐楊峰，聶海英，唐廷崇，彭健波，陶 卿，何家康,*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530003)

苦玄參為玄參科苦玄參屬植物，別名苦草、蛇總管、魚膽草等[1]，味極苦、性寒，可用于治療發(fā)熱、咽喉腫痛、腸胃不適、下痢、蛇咬傷及癰癤等，是清熱消炎的良藥[2]?？嘈⒌闹饕钚猿煞譃槿祁?、黃酮類及苯乙醇苷類化合物等[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦玄參具有抗菌、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛等功效[4-9]。桃金娘是桃金娘科桃金娘屬植物，別名金絲桃、山稔、稔果、水刀蓮等，全株供藥用，其中，桃金娘根含有三萜類、鞣質(zhì)類等活性成分，具有理氣止痛、利濕止瀉、收斂、祛瘀止血及益腎養(yǎng)血等功效[10-11]。

復(fù)方苦玄參顆粒是以中草藥苦玄參為主要成分，輔以桃金娘根一味中藥，經(jīng)提取加工精制而成的中藥復(fù)方顆粒制劑。為保證臨床療效及有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究參照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版二部)[12-13]等，建立了復(fù)方苦玄參顆粒中的苦玄參及桃金娘根TLC鑒別方法，并建立了苦玄參苷IA的含量分析方法，為復(fù)方苦玄參顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀(LC-20A)，日本島津公司產(chǎn)品；電子分析天平(BP211D)，德國賽多利斯集團(tuán)產(chǎn)品；超聲儀(B3200S-T)，必能信超聲有限公司產(chǎn)品；全自動薄層板器(939)，重慶南岸貝爾德儀器技術(shù)廠產(chǎn)品；色譜柱(Waters Symmetry C18，5 μm，4.6×250 mm)，美國Waters公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 苦玄參苷IA對照品(批號111745-200501)，中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；乙腈、甲醇(色譜純)、硅膠G(化學(xué)純)、南寧恒鑫生物有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯、甲酸、苯、香草醛、濃硫酸、鹽酸、三氯甲烷(分析純)，南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)藥物 3批復(fù)方苦玄參顆粒樣品(批號20151008、20151015、20151022)、缺苦玄參的陰性樣品(批號20150701)、缺桃金娘根的陰性樣品(批號20150708)，以上顆粒樣品均由廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 鑒別方法

1.2.1.1 苦玄參的鑒別 稱量本品適量約5 g，加乙酸乙酯-甲醇(5∶1)混合液25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品提取液；另取缺苦玄參的陰性樣品，同法制得陰性樣品液；此外，分別取苦玄參對照藥材及苦玄參苷IA對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的藥液，作為對照藥材及對照品藥液。按照薄層色譜法《中華人民共和國獸藥典》(2015年版二部)附錄[12]試驗(yàn)，吸取上述藥液各3 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以50 mg/mL香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.1.2 桃金娘根的鑒別[13]稱量本品適量約5 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺桃金娘根的陰性樣品，同法制得陰性樣品液；此外，精密稱取桃金娘根對照藥材1 mg，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，得到濃度為1 mg/mL的對照藥材提取液,吸取上述藥液各3 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-苯-甲醇-甲酸(15∶15∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.1.3 專屬性考察 分別配制缺苦玄參、桃金娘根的陰性樣品，按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的薄層鑒別方法檢測，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果考察該方法對藥材的薄層鑒別是否具備專屬性。

1.2.1.4 重復(fù)性考察 取3批樣品，按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的薄層鑒別方法進(jìn)行檢測，考察該方法的重復(fù)性。

1.2.2 含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：乙腈-水(35∶65)；檢測波長：264 nm；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2.2 對照品藥液的制備 取苦玄參苷IA對照品適量，精密稱定，稀釋制成每1 mL約含0.1 mg的藥液，即得。

1.2.2.3 供試品藥液的制備 稱取復(fù)方苦玄參顆粒適量，置具塞錐形瓶中，加入600 mL/L甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用600 mL/L的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.4 陰性樣品液的制備 按標(biāo)準(zhǔn)處方比例，制備缺苦玄參的陰性顆粒樣品，再按供試品的制備方法制備陰性樣品液。

1.2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取苦玄參苷IA對照品藥液、供試品藥液、缺苦玄參的陰性樣品液按色譜條件測定，考察方法的專屬性。

1.2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和線性關(guān)系的考察 精密吸取上述對照品藥液適量，制成不同濃度對照品藥液，按色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，繪制苦玄參苷IA標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察苦玄參苷IA在規(guī)定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

1.2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號復(fù)方苦玄參顆粒供試品，稱取3份顆粒樣品，分別加入3個不同濃度的苦玄參苷IA對照品藥液各1 mL，平行3份，再按供試品制備方法處理，按標(biāo)準(zhǔn)的色譜條件測定，記錄峰面積，按峰面積計(jì)算每份樣品的苦玄參苷IA含量，分別計(jì)算回收率(%)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)。

1.2.2.8 精密度試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批號復(fù)方苦玄參顆粒供試品，平行6份，按1.2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品藥液，按色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)。中間精密度試驗(yàn)：在同一個實(shí)驗(yàn)室于不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備對樣品進(jìn)行測定，計(jì)算其RSD(%)。

1.2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號復(fù)方苦玄參顆粒供試品，按1.2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品藥液，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣10 μL，考察其穩(wěn)定性。

1.2.2.10 樣品測定 按色譜條件方法測定3批復(fù)方苦玄參顆粒樣品的含量，計(jì)算苦玄參苷IA的含量。

2 結(jié)果

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 苦玄參的鑒別 3批復(fù)方苦玄參顆粒(批號20151008、20151015、20151022)，按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的薄層鑒別方法檢測，結(jié)果顯示，在薄層色譜中，3批供試品在與苦玄參苷IA對照品及苦玄參對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，背景清晰，分離效果好，無干擾，結(jié)果易判斷，符合薄層色譜系統(tǒng)適用性檢驗(yàn)。因此，該項(xiàng)定性鑒別方法對供試品的處理及展開系統(tǒng)的選擇是合理的；同法檢測缺苦玄參的陰性樣品，結(jié)果顯示,在與苦玄參苷IA對照品及苦玄參對照藥材相應(yīng)的位置無特征熒光斑點(diǎn)(圖1)，說明對苦玄參的薄層鑒別具備專屬性。

1.苦玄參對照藥材；2.陰性樣品；3.苦玄參苷IA對照品；4～6.供試樣品(20151008、20151015、20151022)

1.Picriafeltarraecontrol;2.Negative sample;3.Standard of picfeltarraenin IA;4-6.Samples (20151008,20151015,20151022)

圖1復(fù)方苦玄參顆粒中苦玄參鑒別薄層色譜圖

Fig.1 The thin layer chromatogram identification ofPicriafeltarraein Compound Kuxuanshen Granule

2.1.2 桃金娘的鑒別 3批復(fù)方苦玄參顆粒(批號0151008、20151015、20151022)，按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的薄層鑒別方法檢測，結(jié)果顯示，在薄層色譜中，3批供試品在與桃金娘根對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，背景清晰，分離效果好，無干擾，結(jié)果易判斷，符合薄層色譜系統(tǒng)適用性檢驗(yàn)，因此，該項(xiàng)定性鑒別方法對供試品的處理及展開系統(tǒng)的選擇是合理的；而在實(shí)驗(yàn)室配制缺桃金娘根的陰性樣品，同法檢測，結(jié)果顯示,在與桃金娘根對照藥材相應(yīng)的位置無特征熒光斑點(diǎn)(圖2)，說明對桃金娘根的薄層鑒別具備專屬性，可作為標(biāo)準(zhǔn)中桃金娘根的鑒別方法。

1.桃金娘根對照藥材；2.陰性樣品；3.供試樣品(20151008、20151015、20151022)

1.Rhodomyrtustomentosacontrol;2.Negative sample;3-5.Samples(20151008,20151015,20151022)

圖2復(fù)方苦玄參顆粒中桃金娘根鑒別薄層色譜圖

Fig.2 Thin layer chromatogram identification ofRhodomyrtustomentosain Compound Kuxuanshen Granule

2.2 含量測定

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn) 結(jié)果表明，供試品中苦玄參苷IA與相鄰峰的分離度良好(均大于1.5)；理論塔板數(shù)按苦玄參苷IA色譜峰計(jì)算，為14 000(圖3)；陰性樣品對測定無干擾，說明方法的專屬性良好(圖4)。

2.2.2 線性和范圍考察試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)試驗(yàn)得苦玄參苷IA的回歸方程為：y=7 628.4x+16 310，R2=0.999 3。結(jié)果表明，苦玄參苷IA在21.08 μg/mL～105.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖6)。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

2.2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果見表1。樣品中苦玄參苷IA的平均含量為3.18 mg/g，RSD為0.001%,表明儀器的精密度良好。

2.2.3.2 中間精密度試驗(yàn) 結(jié)果見表2。樣品中苦玄參苷IA的平均含量為3.20 mg/g，RSD為0.001%,表明儀器的精密度良好。

1.苦玄參苷IA

1.Picfeltarraenin IA

圖3苦玄參苷IA對照品色譜圖

Fig.3 The chromatogram of standard picfeltarraenin IA

圖4 陰性樣品溶液色譜圖

圖5 苦玄參苷IA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.苦玄參苷IA

1.picfeltarraenin IA

圖6 供試品溶液色譜圖

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見表3。24 h內(nèi)復(fù)方苦玄參顆粒供試品中苦玄參苷IA的平均含量為3.03 mg/g，RSD為0.02%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表4?？嘈④誌A的平均回收率為98.07%；RSD為0.01%(n=6)。結(jié)果表明，本法用于復(fù)方苦玄參顆粒中苦玄參苷IA含量測定的準(zhǔn)確度良好。

2.2.6 樣品測定 3批復(fù)方苦玄參顆粒樣品(批號:20151008、20151015、20151022)含量測定結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 3批復(fù)方苦玄參顆粒樣品的含量

3 討論

3.1 關(guān)于苦玄參和桃金娘根的薄層鑒別

關(guān)于苦玄參的薄層色譜鑒定方法，本研究參照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版二部)[12]收載的藥材苦玄參的薄層鑒別方法。用此方法進(jìn)行復(fù)方苦玄參顆粒中苦玄參的薄層鑒別，結(jié)果分離效果較好，該法對苦玄參的鑒別符合專屬性、重復(fù)性及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求，可作為標(biāo)準(zhǔn)中苦玄參的鑒別方法。

關(guān)于桃金娘根的薄層色譜鑒定方法，本研究參照《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2010年版)[13]收載的藥材桃金娘根的薄層色譜鑒定方法，并且進(jìn)行了薄層色譜條件的優(yōu)化，最后確定以三氯甲烷-苯-甲醇-甲酸(15∶15∶4∶2)為展開劑，進(jìn)行復(fù)方苦玄參顆粒中桃金娘根的薄層鑒別，該法對桃金娘根的鑒別符合專屬性、重復(fù)性及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求，可作為標(biāo)準(zhǔn)中桃金娘根的鑒別方法。

3.2 高效液相色譜條件的確定

對苦玄參苷IA對照品的紫外吸收光譜(200 nm～400 nm)測定結(jié)果表明，苦玄參苷IA在264 nm附近有強(qiáng)吸收。為能靈敏地檢出上述成分，本方法選擇264 nm作為檢測波長。而其他色譜條件，如流動相及其配比、柱溫和流速等，本研究參照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版二部)收載的藥材苦玄參的含量測定方法，并進(jìn)行多次的篩選、驗(yàn)證，最終確定上述色譜條件。結(jié)果顯示，供試品在該色譜條件下，苦玄參苷IA的峰純度良好，未與其他峰混雜，專屬性好。