柑橘四倍體田間化學(xué)誘導(dǎo)技術(shù)研究

萬水林,劉召亮,胡鐘東,閆承璞, DUAN Xian-ming,王雨亭

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江西 南昌 330200;2. Bay Food Tech. CA, 95129, USA)

當(dāng)前我國(guó)柑橘生產(chǎn)中,大部分栽培品種有核,不受消費(fèi)者歡迎;有些柑橘主栽品種因品質(zhì)較差,在市場(chǎng)上缺乏競(jìng)爭(zhēng)力;還有一些地方良種在國(guó)內(nèi)外新品種不斷出現(xiàn)的今天,其傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)逐漸失去,優(yōu)勢(shì)不再。因此對(duì)柑橘有核品種進(jìn)行無核化改良,提升栽培品種和地方良種的品質(zhì),開展柑橘倍性育種很有必要。而要進(jìn)行倍性育種,首先必須開展多倍體的誘導(dǎo)研究,從而為柑橘倍性雜交提供四倍體親本。四倍體的產(chǎn)生方式包括自然發(fā)生和人工誘導(dǎo)兩種。陳全友等在蘇北灌云縣發(fā)現(xiàn)了1株自然四倍體的枳幼樹[1],這種自然四倍體的發(fā)生概率極低,一般均從實(shí)生種子中篩選獲得。美國(guó)農(nóng)業(yè)部通過對(duì)種子幼苗外部形態(tài)特征的鑒別,獲得了多個(gè)柑橘種類的同源四倍體[2];借助流式細(xì)胞儀,西班牙從苗床中篩選出30多株自發(fā)性同源四倍體[3];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)根據(jù)幼苗形態(tài)觀察結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè),從枳等10個(gè)砧木類型的實(shí)生種子幼苗中發(fā)現(xiàn)了部分四倍體[4],從早金甜橙等9個(gè)品種的實(shí)生后代中篩選出了部分同、異源四倍體和同、異源三倍體[5]。人工誘導(dǎo)為獲得四倍體的主要方式,陳大成等(1985)采用田間活體誘導(dǎo)方式,用秋水仙素處理柑桔栽培品種嫁接苗,獲得了同源四倍體,并在其中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有希望作為經(jīng)濟(jì)栽培的四倍體柑桔類型——同源四倍體十月桔[6]。由于進(jìn)行活體誘導(dǎo)時(shí)無法保證細(xì)胞的分裂同步,因此活體誘導(dǎo)較難得到純合四倍體植株,大多為嵌合體,且誘導(dǎo)率低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多倍體大多是通過組織培養(yǎng)、生物技術(shù)等離體培養(yǎng)方式獲得的,例如：劉繼紅等采用電融合方法誘導(dǎo)澳洲指橘,獲得了柑橘屬間四倍體體細(xì)胞雜種[7];洪柳等通過組培方法對(duì)椪柑種子進(jìn)行培養(yǎng),獲得了7株四倍體植株[8];美國(guó)Grosser等[9]、Viloria等[10]先后采用原生質(zhì)體融合技術(shù),獲得了柑橘體細(xì)胞雜種;西班牙Pablo Aleza等采用組培砧苗,用微芽嫁接結(jié)合秋水仙素誘導(dǎo)處理獲得了柑橘四倍體[11];何建等用胺磺靈浸泡椪柑莖段,獲得了椪柑四倍體[12]。

目前,對(duì)柑橘多倍體的誘導(dǎo)研究大都集中在組織培養(yǎng)等離體誘導(dǎo)方法上,該方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行,易于控制,誘導(dǎo)率較高；而對(duì)田間活體誘導(dǎo)研究較少。但采用田間活體誘導(dǎo)方式,操作簡(jiǎn)單,無需煉苗,誘導(dǎo)成功后可快速投入應(yīng)用。由于柑橘種類較多,不同的柑橘種類之間樹勢(shì)、枝梢和芽的外部形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)特征均有較大差異,因而對(duì)所需的誘導(dǎo)藥劑及其使用濃度等可能存在差別,因此,我們開展了柑橘四倍體田間化學(xué)誘導(dǎo)技術(shù)的試驗(yàn)研究,以便為柑橘田間多倍體的高效誘導(dǎo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為江西目前栽培較多的柑橘品種,包括南豐蜜橘、新余蜜橘、椪柑、金沙柚以及文旦柚。試驗(yàn)在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)藥劑 選用目前對(duì)植物四倍體誘導(dǎo)效果最佳的秋水仙素(Colchicine)[100 mg/支,由生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)]、氨磺樂靈(Oryzalin)(100 mg/支,由美國(guó)Sigma-Alorich公司生產(chǎn))、氟樂靈(Trifluralin)(250 mg/支,由美國(guó)Sigma-Alorich公司生產(chǎn))。

1.2.2 藥劑配制 將秋水仙素直接用水溶解,按要求配制成0.025%～0.200%的溶液；配制好后,再加入1%DMSO(二甲基亞砜),待用。在室溫下將0.1 g氨磺樂靈溶于0.5 mL丙酮溶劑,溶解過程中加蓋防揮發(fā)；再加入1 mL乙醇,混勻后再加入0.2 mL吐溫-20,充分混合；最后用丙二醇定容至2 mL,配制成5%的氨磺樂靈母液；試驗(yàn)前再配制成各種所需的濃度。將0.1 g氟樂靈用0.4 mL二甲基亞砜溶解后,再用60 ℃左右的溫水稀釋至所需的不同濃度。

1.2.3 處理方法 在2015年,以0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的秋水仙素進(jìn)行新余蜜橘活體芽的誘導(dǎo)效果比較;不同柑橘品種間的誘導(dǎo)效果比較統(tǒng)一采用0.15%的秋水仙素。在2016年，以0.025%、0.05%、0.075%和0.10%的秋水仙素進(jìn)行新余蜜橘誘導(dǎo)效果的比較;不同柑橘品種間的誘導(dǎo)效果比較統(tǒng)一采用0.05%的秋水仙素溶液。在2017年,采用0.10%的處理濃度,進(jìn)行了同一濃度條件下不同藥劑田間誘導(dǎo)的比較試驗(yàn)。

活體芽誘導(dǎo)處理方法:在2015年3月春芽發(fā)芽前,選枝條中上部腋芽,用棉球飽和吸取事先配制好的處理溶液,置于已剪去葉片的腋芽上,然后用parafilm封口膜將棉球和腋芽密封包裹,做好標(biāo)記,10 d后,去掉包裹。2016年的試驗(yàn)則在2015年試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),除降低了秋水仙素的使用濃度外,為保持處理部位相對(duì)穩(wěn)定的溫度環(huán)境,保持藥劑的穩(wěn)定性,在用封口膜包好后,外部再用黑色膠布包裹。2017年的處理方法同2016年。

1.3 倍性檢測(cè)

在處理1個(gè)月后,檢查處理芽的發(fā)芽情況。在處理2個(gè)月后,用德國(guó)Partec公司生產(chǎn)的CyFlow PA型流式細(xì)胞儀檢測(cè)葉片的染色體倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理對(duì)新余蜜橘發(fā)芽率的影響

用不同濃度的秋水仙素誘導(dǎo)新余蜜橘活體芽時(shí),秋水仙素對(duì)芽的正常萌發(fā)有一定程度的影響,結(jié)果見圖1。發(fā)現(xiàn)以0.05%的秋水仙素處理時(shí)發(fā)芽率最高,為81.20%;用0.20%的秋水仙素處理時(shí)發(fā)芽率最低,為25.00%。隨著秋水仙素使用濃度的提高,柑橘的發(fā)芽率明顯下降,說明秋水仙素對(duì)柑橘芽的萌發(fā)有抑制作用,而且隨著秋水仙素使用濃度的增加,抑制作用增強(qiáng)。

圖1 不同濃度秋水仙素對(duì)新余蜜橘發(fā)芽率的影響(2015年)

2.2 不同濃度秋水仙素對(duì)新余蜜橘四倍體的誘導(dǎo)效果

連續(xù)兩年的試驗(yàn)結(jié)果(表1和圖2)表明,對(duì)新余蜜橘活體芽四倍體誘導(dǎo)效果最佳的秋水仙素處理濃度為0.10%，在該濃度條件下,2015年新余蜜橘四倍體的誘導(dǎo)率達(dá)13.43%,2016年新余蜜橘四倍體的誘導(dǎo)率達(dá)14.29%。秋水仙素使用濃度過高或過低均會(huì)降低四倍體的誘導(dǎo)效果。

2.3 秋水仙素對(duì)不同柑橘品種的四倍體誘導(dǎo)效果

2015年誘導(dǎo)比較試驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)秋水仙素處理后,不同柑橘品種間的發(fā)芽率和四倍體的誘導(dǎo)效果差異均較大,以新余蜜橘的發(fā)芽率最高,為36.00%;以南豐蜜橘的四倍體發(fā)生率最高,為5.00%(表2)。

表1 不同濃度秋水仙素對(duì)新余蜜橘四倍體誘導(dǎo)效果的影響

注：表頭中的百分?jǐn)?shù)為秋水仙素使用濃度。4X指四倍體，2X指二倍體，下同。

圖2 流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)結(jié)果(左圖為二倍體;右圖為四倍體)表2 0.15%秋水仙素對(duì)不同柑橘品種四倍體的誘導(dǎo)效果(2015年)

項(xiàng)目新余蜜橘南豐蜜橘溫州蜜柑文旦柚處理芽數(shù)/個(gè)50404927發(fā)芽數(shù)/個(gè)1811112發(fā)芽率/%36.0027.5022.457.414X數(shù)/個(gè)12104X發(fā)生率/%2.005.002.040.00

在2015年的試驗(yàn)中,采用的秋水仙素處理濃度為0.15%,四倍體誘導(dǎo)率較低,最高的南豐蜜橘四倍體的誘導(dǎo)率也僅為5.00%。因此，在2016年的試驗(yàn)中降低秋水仙素的使用濃度至0.05%,結(jié)果(表3)表明：除新余蜜橘四倍體的誘導(dǎo)率較低外,其它柑橘品種的誘導(dǎo)率均較高,其中南豐蜜橘的誘導(dǎo)率高達(dá)42.86%；另外，秋水仙素處理濃度降低后,各柑橘品種的發(fā)芽率未受到藥劑影響,均達(dá)到100%。

表3 0.05%秋水仙素對(duì)不同柑橘品種四倍體的誘導(dǎo)效果(2016年)

2.4 不同處理藥劑對(duì)柑橘四倍體的誘導(dǎo)效果

采用秋水仙素、氨磺樂靈和氟樂靈分別對(duì)新余蜜橘進(jìn)行田間四倍體誘導(dǎo)試驗(yàn),處理濃度均采用0.10%,將試驗(yàn)效果列于表4。結(jié)果表明：在3種誘導(dǎo)藥劑中,對(duì)新余蜜橘四倍體誘導(dǎo)效果最佳的藥劑為秋水仙素,誘導(dǎo)率為30%；其次為氨磺樂靈,誘導(dǎo)率為7.69%；而氟樂靈無誘導(dǎo)效果。

表4 不同處理藥劑對(duì)柑橘四倍體的誘導(dǎo)效果(2017年)

3 討論

秋水仙素已被證實(shí)是誘導(dǎo)植物多倍體的最為有效的藥劑,它對(duì)細(xì)胞分裂活躍狀態(tài)的組織具有有效的刺激作用,可使分生組織的染色體加倍,所以它常被用于處理種子、子葉、生長(zhǎng)點(diǎn)等部位[13-14]。前人研究表明,組織培養(yǎng)等離體方式的多倍體誘導(dǎo)效果與使用的具體誘導(dǎo)劑的濃度和處理時(shí)間以及植物種類、器官和溫度等有關(guān),使用濃度過高、處理時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使植物受到傷害；而濃度過低、時(shí)間過短又起不到很好的誘導(dǎo)效果[15-16]。在本研究中,所選用的柑橘材料為剛萌發(fā)的腋芽,是因?yàn)槠浼?xì)胞分裂旺盛,有利于對(duì)藥劑的吸收。在2015年試驗(yàn)中由于使用的秋水仙素濃度過高,明顯影響了柑橘的發(fā)芽。在2016年,降低秋水仙素的使用濃度至0.05%,結(jié)果發(fā)芽率均達(dá)到100%,而且四倍體的誘導(dǎo)率也得到了極大的提高。

用秋水仙素處理植株時(shí),還要注意對(duì)溫度條件的控制,低溫會(huì)阻礙細(xì)胞分裂,過高的溫度則會(huì)使秋水仙素對(duì)細(xì)胞的損害加大,同時(shí)也會(huì)加速秋水仙素的變性。在2016年試驗(yàn)中,用封口膜密封后,外部再用黑色膠布包裹,有效防止了陽光直射引起的溫度過高,避免或減輕了藥劑傷害,經(jīng)秋水仙素處理后各柑橘品種的發(fā)芽率均未受到任何影響。

除草劑氨磺樂靈、氟樂靈具有低的毒性和良好的多倍體誘導(dǎo)效果，在多種植物上已得到應(yīng)用[17-19]；用氨磺樂靈也成功誘導(dǎo)離體柑橘外植體獲得了四倍體材料[11-12]。但本研究發(fā)現(xiàn),氨磺樂靈對(duì)柑橘田間活體芽多倍體的誘導(dǎo)效果不如秋水仙素,這與氨磺樂靈在組織培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)結(jié)果[11,20]類似。

前人的相關(guān)研究表明,多倍體誘導(dǎo)中的嵌合體嚴(yán)重是多倍體育種中的難點(diǎn)[21-22]。Aleza用0.1%的秋水仙素和0.1%的氨磺樂靈分別對(duì)離體克里曼丁等橘類的腋芽誘導(dǎo)后進(jìn)行微芽嫁接,四倍體的誘導(dǎo)率分別為15%和33%；秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體存在一定比例的嵌合體,但產(chǎn)生的四倍體較氨磺樂靈誘導(dǎo)的生長(zhǎng)更快[23]。而我們的研究發(fā)現(xiàn),采用相應(yīng)的處理技術(shù)后,嵌合體的發(fā)生率并不高,2015年只發(fā)現(xiàn)有極少量嵌合體發(fā)生,2016年則未檢測(cè)出嵌合體,均為純四倍體,可能與選擇了適宜的誘導(dǎo)時(shí)期和創(chuàng)造了有利的誘導(dǎo)條件有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：對(duì)柑橘田間活體芽誘導(dǎo)四倍體效果最佳的藥劑為秋水仙素,其適宜的處理濃度為0.10%；氨磺樂靈和氟樂靈的誘導(dǎo)效果較差;秋水仙素對(duì)不同柑橘品種發(fā)芽率和四倍體誘導(dǎo)率的影響均存在較大的差異,以新余蜜橘的發(fā)芽率最高,以南豐蜜橘的四倍體誘導(dǎo)率最高;進(jìn)行田間活體誘導(dǎo)時(shí),輔以適宜的技術(shù)措施,可大大提高發(fā)芽率,并降低嵌合率。