一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

王佳楠

摘要：采集室內(nèi)觀賞植物巴西木葉片，經(jīng)過富集培養(yǎng)、血平板篩選、發(fā)酵液排油能力測定和發(fā)酵液表面張力測定等，篩選出具有產(chǎn)生物表面活性劑能力的菌株J3-21。對其培養(yǎng)條件進(jìn)行，確定氯化銨和蔗糖為氮源和碳源時，在28℃條件下，再補充部分酵母粉，可以使發(fā)酵液表面張力可降低至25 mN/m。

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；表面張力；培養(yǎng)條件優(yōu)化

生物表面活性劑（biosurfactant）是由微生物產(chǎn)生的具有高表面活性的生物分子，是集親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一身的兩親化合物[1，2]。相對于化學(xué)合成的表面活性劑，生物表面活性劑對生態(tài)系統(tǒng)的毒性較低，且可生物降解。因此，生物表面活性劑的特性決定了其在醫(yī)藥、石油工業(yè)、化妝品、洗滌劑、環(huán)境工程和食品工業(yè)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[2]。植物葉片表面因為存在蠟質(zhì)等植物保護(hù)性物質(zhì)，是篩選產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的微生物的重要環(huán)境之一。

1.材料與方法

1.1植物樣品

室內(nèi)景觀植物巴西木葉片。

1.2儀器與試劑

LDZX-40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器、ZD-85恒溫振蕩器、FA1104電子天平、SW-CJ2FD潔凈工作臺、LRH-280生化培養(yǎng)箱、JK99C全自動表面張力儀。試劑均為分析純。

1.3方法

1）菌株富集與分離。稱取樣品10g，加入90ml無菌水，150r/min搖床振蕩1h，取上清液10ml接種到100ml已滅菌的富集培養(yǎng)集中，于37℃、150r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3d。在同樣條件下進(jìn)行二次培養(yǎng)。取二次富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液1mL，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度）。巴西木葉片，置于富集培養(yǎng)基中，經(jīng)過15天富集后，將富集液體涂布于血平板培養(yǎng)基上，挑去能夠產(chǎn)生溶血圈的菌株，作為備選菌株。

2）菌株的篩選。將純菌株接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72h。取100μl發(fā)酵液接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、150r/min培養(yǎng)3d。取直徑20cm培養(yǎng)皿，經(jīng)過二次酸洗后加二次蒸餾水30ml，滴加8ml液體石蠟，等待20-30min，形成穩(wěn)定油膜后加入100μl發(fā)酵液于油膜中心，測定排油圈直徑。

3）發(fā)酵培養(yǎng)。將純菌株接種到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、150r/min條件下培養(yǎng)72h。

4）單因素培養(yǎng)條件優(yōu)化。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對碳源、氮源的種類及培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素試驗，確定C源、N源的種類及培養(yǎng)溫度。

5）正交實驗設(shè)計。以碳源、氮源、酵母粉和培養(yǎng)時間為影響因素，以各因素添加量和時間為不同水平，以表面張力下降情況和菌濃作為考察指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平正交試驗，如下表1：

6）菌種鑒定 對篩選所得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色及生理生化試驗鑒定，確定細(xì)菌的種屬。

2.結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)表面活性劑菌株的分離篩選結(jié)果

對巴西木葉片中的微生物種群中表面活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株進(jìn)行富集培養(yǎng)，再經(jīng)過血平板分離，共獲得21株備選細(xì)菌菌株，對各菌株進(jìn)一步考察，測定發(fā)酵液的排油能力，得到備選產(chǎn)表面活性劑的菌株4株，測量到這些菌株的排油圈直徑，大于4cm，說明這些菌株的代謝產(chǎn)物有較好的排油性能，而效果最好的一株菌編號為J3-21，排油圈直徑達(dá)6.5cm。

2.2菌株培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

1）碳源的選擇。分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉、草酸、可溶性淀粉為碳源，在28℃，初始pH值為7.0～7.2，150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72h，分別測定發(fā)酵液的排油能力。

由圖1a可知，蔗糖為碳源時菌株J3-21發(fā)酵液的排油活性最好，表面張力降低至27.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7mN/m），因此，選擇蔗糖為最佳碳源。

2）氮源的選擇。分別以硝酸鈉、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、牛肉膏這 5種氮源，以蔗糖為碳源，初始pH值為7.0～7.2，28℃、150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3d后，測定發(fā)酵液的排油活性。

由圖1b可知，氯化銨為碳源時菌株J3-21發(fā)酵液的表面張力降低至25.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7mN/m），因此，選擇氯化銨為最佳氮源。

3）培養(yǎng)溫度的選擇。以蔗糖為碳源，氯化銨為氮源，初始pH值為 7.0～7.2，分別于24、28、32、36℃，150r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3天，測定發(fā)酵液的排油活性。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時，

由圖1c可知，培養(yǎng)溫度為28℃時菌株J3-21發(fā)酵液的表面張力降低至25.2mN/m（注：20攝氏度條件下，空白培養(yǎng)基的表面張力為65.7 mN/m），因此，選擇28℃為較優(yōu)良的培養(yǎng)溫度。

2.3 菌種鑒定

對菌株J3-21進(jìn)行了革蘭氏染色、芽孢染色。在油鏡下觀察，該菌株呈細(xì)長桿狀；革蘭氏染色后，菌體為紫色；經(jīng)孔雀綠-番紅染色后，可觀察到紅色的菌體和綠色的芽孢區(qū)，芽孢較小。J3-21的生理生化反應(yīng)結(jié)果見表2：

3.結(jié)論

綜合以上結(jié)果，培養(yǎng)基中，氮源和酵母粉添加量會對J3-21發(fā)酵液中菌濃和表面活性物質(zhì)產(chǎn)生較大影響，生物表面活性物質(zhì)產(chǎn)量與菌濃存在一定的負(fù)相關(guān)，可能表活物質(zhì)對菌株具有一定的抑制作用，次級代謝產(chǎn)物的積累不利于菌體的生長。因此，后期實驗中準(zhǔn)備通過培養(yǎng)中進(jìn)行補料的形式，在較高菌濃情況下對培養(yǎng)基進(jìn)行補料以產(chǎn)生更多的表面活性物質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張卉，郝國良，徐俊斌.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].沈陽師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，04：477-485

[2]盧國滿.產(chǎn)表面活性劑菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及定量研究[D].湖南大學(xué)，環(huán)境科學(xué)專業(yè)，2006年