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    蓮子多糖分離純化的研究*

    2018-08-22 08:43:34常青彭暄
    福建輕紡 2018年8期
    關(guān)鍵詞:葡聚糖蓮子蛋白酶

    常青,彭暄

    (福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

    蓮子又稱蓮籽、蓮米、蓮肉、蓮蓬子,是睡蓮科植物蓮的成熟種子[1]。蓮子有四大品系,主要分布在我國的福建、湖北、湖南、浙江、江蘇、河北等地,有3000多年的種植歷史,其中以湖南湘蓮、福建建蓮、浙江衢蓮為上品,福建建寧和江西廣昌分別作為“中國建蓮之鄉(xiāng)”和“中國白蓮之鄉(xiāng)”[2]。多糖是一類由多個單糖基通過糖苷鍵結(jié)合的方式形成的天然大分子物質(zhì),是生物體內(nèi)除核酸、蛋白質(zhì)以外的又一類重要生物分子[3]。

    多糖最常用的提取方法為水提醇沉法,此方法提取的多糖常常含有較多雜質(zhì)(如蛋白、色素等),所以需要對提取得到的多糖進行分離純化[4]。為了能到達一個最佳的脫蛋白的效果,通常將酶法脫蛋白與sevag法脫蛋白聯(lián)用[5]。多糖的純化通常采用柱層析法,常用的凝膠填料有Sephadex和Sepharose兩種。陳嬋[6]采用水提法提取蓮子多糖,但是提取率較低,同時也發(fā)現(xiàn)超聲波對蓮子多糖的提取具有強化作用,微波對蓮子多糖的提取具有輔助作用。

    但是超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝尚未見報道,因此本文主要研究超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝,通過酶法脫蛋白結(jié)合sevag法脫蛋白和經(jīng)過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后冷凍干燥獲得純化的蓮子多糖。通過考察不同的酶解溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、酶解時間(40、50、60、70、80、90 min)、酶添加量(80、100、120、140、160 U/mL),得到蛋白酶酶解的最佳工藝,通過sevag法對酶法脫蛋白后的多糖進一步脫蛋白,得到sevag法脫蛋白的最佳工藝。將脫蛋白后的蓮子多糖過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱,用全波段紫外-可見光光譜掃描,對純化后的多糖進行純度鑒定。

    1 材料與儀器

    1.1 材料與試劑

    木瓜蛋白酶,索萊寶生物科技有限公司;牛血清蛋白、考馬斯亮藍染液、正丁醇、苯酚、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純;DEAE-52纖維素、Sephadex G-20葡聚糖凝膠為美國Sigma公司;實驗用水為蒸餾水。

    1.2 主要儀器

    DHL-A恒流泵:上海金朋分析儀器有限公司;

    UV-1100型紫外可見分光光度計:上海美普達儀器有限公司;

    丹瑞HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋:上海亞榮生化儀器廠;

    恒溫水浴搖床:尤尼柯(上海)儀器有限公司;

    玻璃層析柱(Φ16mm×400mm):上海精科實業(yè)有限公司。

    2 試驗方法

    2.1 蓮子多糖的制備

    取適量去心干蓮子于植物粉碎機中粉碎,過40目篩,得蓮子粉末樣品。取5 g蓮子粉末,置于鹵素快速水分測定儀中測定粉末樣品的水分含量,所制得蓮子粉末的水分含量小于3%。取蓮子粉末樣品于錐形瓶,按液料比55 mL/g的比例加入二次蒸餾水,在超聲波功率110 W和微波功率110 W的條件下提取70 s,樣品浸提液離心(4000 r/min,20 min)得濾液,加入4倍體積的常溫?zé)o水乙醇,室溫下靜置沉降20 h后,再次離心(4000 r/min,20 min)。棄上清液,取沉淀,用二次蒸餾水溶解沉淀后冷凍干燥,得蓮子多糖。

    2.2 多糖含量的測定

    以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸-苯酚比色法來測定蓮子多糖[7]。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制:分別配制8、16、24、32、40 g/mL的葡萄糖溶液,分別吸取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2 mL,依次加入濃度為6%的苯酚1.0 mL,濃硫酸5.0 mL,顯色后于冷水中冷卻15 min,在波長490 nm處測定吸光度值,空白對照用蒸餾水做試劑空白。

    實驗結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線:

    表明在0~0.08 mg/mL范圍內(nèi)葡萄糖溶液濃度與吸光度OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    X--表示葡萄糖溶液濃度,單位mg/mL;

    Y--表示吸光度OD值。

    2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

    牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制[8,9]:采用考馬斯亮藍法進行顯色測定,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,取1 mL加到試管中。加入考馬斯亮藍染液5.0 mL,混勻后室溫下靜置3 min,以試劑空白作對照,在波長595 nm處測定吸光值。

    樣品的測定:配制1 mg/mL的蓮子多糖溶液,吸取樣品液1.0 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的步驟測定吸光值,計算樣品蛋白質(zhì)的濃度。

    牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0066x+0.0092,R2= 0.9994。表明濃度在0~0.1 mg/mL的范圍內(nèi)牛血清蛋白溶液的濃度與吸光度值的線性關(guān)系良好(見圖1)。

    2.4 脫蛋白試驗

    2.4.1 酶法脫蛋白

    2.4.1.1 單因素試驗

    取蓮子多糖粉末0.5 g,用蒸餾水溶解,定容至500 mL,以蛋白質(zhì)的脫除率為指標(biāo),考察不同的酶解溫度(20、30、40、50、60、70℃)、酶解時間(40、50、60、70、80、90 min)、酶添加量(80、100、120、140、160 U/mL)蛋白酶對蛋白質(zhì)脫除率的影響。

    2.4.1.2 正交試驗

    在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo),綜合考慮酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶添加量(C)對除蓮子多糖中蛋白質(zhì)的脫除率的影響。

    2.4.2 Sevag法

    Sevag試劑的配制:將氯仿和正丁醇按照4∶1的比例配制。

    取酶解脫蛋白后的蓮子多糖樣品液30 mL,加入10mL的Sevag試劑,用恒溫水浴搖床振蕩(200 r/min)20~30 min,離心(4000 r/min)20 min,取少量上清液測定蛋白質(zhì)和多糖的含量,然后將溶液反復(fù)處理5次。按公式計算多糖損失率和蛋白脫除率。

    M1:脫蛋白后的多糖含量(mg)

    M2:脫蛋白前的多糖含量(mg)

    C1:脫蛋白后的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)

    C2:脫蛋白前的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)

    2.5 DEAE-52纖維素柱分級

    參照Zeng等[10]的方法進行稍加修改,將預(yù)處理后的DEAE-52纖維素填裝于1.6 cm×60 cm的層析柱中,柱高40 cm。用去離子水配制濃度為30 mg/mL蓮子多糖溶液,取10 mL加入DEAE-52纖維素柱上層析分級。0~19管用蒸餾水洗脫、20~120管用0~1 mol/L NaCl溶液進行洗脫,流速:30 mL/h,4 mL/管。

    2.6 Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱分級蓮子多糖

    將預(yù)處理好的Sephadex G-20葡聚糖凝膠填裝于1.6 cm×40 cm的層析柱中,柱高30 cm。將DEAE-52纖維素柱分離的組分單次上樣10 mL,樣品濃度30 mg/mL。用NaCl溶液(0.1 mol/L)洗脫,流速:20 mL/h,每管4 mL,總共收集80管。用苯酚-硫酸法測定,在490 nm處用紫外-可見分光光度計隔管測吸光度值后,作洗脫曲線。收集吸收峰部分的蓮子多糖,洗脫液氯化鈉用透析法除去,將透析后的蓮子多糖溶液濃縮冷凍干燥,即得分離的組分。

    2.7 紫外-可見光譜掃描分析

    分別取脫蛋白后和過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖5 mg用蒸餾水溶解后定容至100 mL,用紫外-可見光譜進行全波段掃描,掃描波長間隔為0.5 nm。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 蓮子多糖脫蛋白試驗

    3.1.1 酶法脫蛋白

    3.1.1.1 單因素實驗

    3.1.1.1.1 不同酶解溫度對蓮子多糖蛋白質(zhì)脫除率的作用

    從圖2可知,溫度在20~50 ℃范圍內(nèi),隨著酶解溫度的升高,蛋白脫除率不斷上升,這可能是因為溫度升高,酶的活力增大,酶解速度加快[11];當(dāng)溫度高于50℃時,蛋白脫除率呈下降趨勢。這可能是因為當(dāng)溫度超過酶的最適溫度后,酶蛋白質(zhì)發(fā)生變性,酶的活力下降,酶解速度下降[12]。因此,酶解溫度選擇50℃。

    圖2 酶解溫度對蛋白質(zhì)脫除率的作用

    3.1.1.1.2 不同酶解時間對蓮子多糖蛋白脫除率的作用

    從圖3可知,當(dāng)酶解時間為40~60 min 時,蛋白質(zhì)脫除率不斷上升,60 min后蛋白脫除率幾乎不變。這可能是因為隨著酶解反應(yīng)時間的增加,酶與底物接觸充分,蛋白質(zhì)脫除率增大,反應(yīng)時間太短,酶解不充分[13];當(dāng)時間達到一定時,底物濃度降低,酶反應(yīng)達到飽和,蛋白的脫除效果受酶解時間的作用不大[14]。因此,最佳酶解時間為60 min。

    圖3 酶解時間對蛋白脫除率的作用

    3.1.1.1.3 不同酶添加量對蓮子多糖蛋白脫除率的作用

    從圖4可知,當(dāng)酶添加量在80~120 U/mL范圍時,蛋白質(zhì)脫除率隨著酶添加量的增加而增加;當(dāng)酶添加量超過120 U/mL時,蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是因為多糖溶液中的蛋白質(zhì),作為蛋白酶的作用底物,隨著酶濃度的增加,酶反應(yīng)速率加快,蛋白質(zhì)脫除效果不斷上升[15];但是當(dāng)酶濃度升高到一定程度時,蛋白酶的酶解底物不足,酶反應(yīng)速率降低[5]。因此,最適酶添加量為120 U/mL。

    圖4 酶量對蛋白脫除率的作用

    3.1.1.2 正交優(yōu)化試驗

    3.1.1.2.1 因素水平表

    在上述實驗的基礎(chǔ)上,以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo),綜合考慮酶解溫度、酶解時間、酶添加量對蛋白質(zhì)脫除率的影響,使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對正交實驗結(jié)果進行分析處理。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計3因素、3水平的正交試驗表(表1)。

    3.1.1.2.2 蓮子多糖脫蛋白最佳工藝條件的確定

    蛋白酶酶法脫蛋白正交試驗結(jié)果見表2。

    由表2可知,比較Rj值得大小,RC>RB>RA,即在所設(shè)定的因素中,C因素對蛋白質(zhì)脫除的作用最大,其次是B因素,A因素。對正交試驗進行直觀分析,將K值進行比較可知,A2B3C2為優(yōu)水平組合,即酶解溫度為50 ℃,酶解時間為70 min,木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL時,蛋白質(zhì)的脫除率最大。

    表1 正交試驗因數(shù)和水平表

    表2 正交試驗結(jié)果

    表3 正交試驗方差分析

    由表3可知,B和C因素作用顯著,A因素作用不顯著,所以需對酶解時間B和酶添加量C因素的各水平進行多重比較。

    多重比較的結(jié)果以B1、B3和C2為最好,根據(jù)實際情況,B因素選擇B1,由于A因素不顯著,故根據(jù)實際情況A因素選擇第1水平,由方差分析和多重比較可得出優(yōu)方案為A1B1C2。由于與正交試驗中的優(yōu)水平組合不一致,需做進一步的驗證實驗,進一步的驗證試驗的結(jié)果為:組合A1B1C2蛋白質(zhì)的脫除率為74.25%,由驗證試驗的結(jié)果可得此次試驗的最優(yōu)方案為A1B1C2,此時,多糖的損失率為5.88% 。

    表4 B因素各水平均值多重比較

    表5 C因素各水平均值多重比較

    3.1.2 Sevag法脫蛋白

    經(jīng)蛋白酶處理后的蓮子多糖,采用sevag法做進一步的處理,蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率情況如圖5所示。

    圖5 Sevag試劑處理結(jié)果

    從圖5可知,sevag法脫蛋白2次后,蛋白質(zhì)脫除率到達最大,多糖損失率不斷上升。綜上,最佳方案為sevag法脫蛋白2次,此時蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率分別為85.5%和7.5%。

    3.1.3 最佳工藝的確定

    蓮子多糖的最佳脫蛋白工藝為:酶解溫度50 ℃、酶解時間50 min、木瓜蛋白酶添加量120 U/mL,此時蛋白質(zhì)脫除率和多糖的損失率分別為74.25%和5.88%。再用sevag試劑處理2次,此時蛋白質(zhì)脫除率為85.5%,多糖損失率為7.5%。

    3.2 蓮子多糖的梯度洗脫

    蓮子多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱線性洗脫分級得到單一組分LSPs-1(如圖6所示),這與陳嬋[6]的結(jié)果一致。將35-58管收集經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后得到純化后的蓮子多糖,經(jīng)測定該組分的回收率為90.18%,說明蓮子多糖已基本洗脫出來。

    采用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析對經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化后蓮子多糖作進一步的分離純化試驗。經(jīng)DEAE-52纖維素柱純化后的單一組分用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線如圖7所示,經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后得到更純的蓮子多糖LSPs-1-1。

    圖7 蓮子多糖P1的Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線

    3.3 純度鑒定

    從圖8可知,脫蛋白后的蓮子多糖在280 nm處無明顯的吸收峰,相比脫蛋白前的蓮子多糖吸收峰小得多,說明經(jīng)過酶法和sevag法脫蛋白后蓮子多糖中的蛋白質(zhì)已基本被除凈。

    圖8 脫蛋白前后紫外-可見光譜全波段掃描圖

    圖9 過柱后紫外-可見光譜全波段掃描圖

    從圖9可以看出,經(jīng)過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖在280 nm處無蛋白質(zhì)吸收峰,說明經(jīng)過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖已經(jīng)沒有蛋白質(zhì),此時的蓮子多糖是一個純的蓮子多糖。這與陳嬋[6]的研究結(jié)果一致,陳嬋用DEAE-SephadexA-25分離蓮子多糖后得到一個組分,經(jīng)Sephrose CL-4B凝膠層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析得到蓮子多糖為純品。

    4 結(jié)論

    ⑴采用蛋白酶酶解和sevag試劑處理后,得到蓮子多糖的酶法脫蛋白最佳工藝為:酶解溫度為50 ℃、酶解時間為50 min和木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL,在此工藝條件下,蛋白質(zhì)脫除率和多糖的損失率為74.25%和5.88%。經(jīng)sevag試劑處理2次后,此時蛋白質(zhì)脫除率為85.5%,多糖損失率為7.5%。

    ⑵采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱對蓮子多糖進行純化,純度鑒定采用紫外-可見光譜掃描法,結(jié)果表明,此分離純化的方法能得到單一組分蓮子多糖,該多糖組分均無蛋白質(zhì)和核酸的吸收峰,說明該法能得到純度較高的多糖。

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