針刺嗅三針對帕金森病小鼠嗅球病理及黑質(zhì)TH表達(dá)的影響

王 強(qiáng)，劉智斌，王 淵，李 杰，魯 剛，馬 雪，郭 陽

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

我國目前正進(jìn)入老齡化社會，帕金森病（PD）作為神經(jīng)內(nèi)科常見病在老年人中的發(fā)病率逐年提高[1-3]。許多帕金森病人在早期，路易小體首先會影響嗅覺系統(tǒng)，如嗅球或嗅前核，導(dǎo)致病人嗅覺障礙[4]。按Braak病理分期，典型的運(yùn)動癥狀在三期以后才會出現(xiàn)，而之前的非運(yùn)動癥狀容易被忽視，有學(xué)者[5-6]甚至認(rèn)為，以嗅覺障礙為主的非運(yùn)動癥狀可以被視作早期帕金森病發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志。脂多糖（LPS）是內(nèi)毒素的主要成分，也是一種革蘭氏陰性菌。研究[7-9]表明，LPS可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，也可以導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失?！靶崛槨悲煼▽ι窠?jīng)退行性病變疾病的相關(guān)臨床癥狀和嗅覺功能障礙均有較好的改善作用?！靶崛槨悲煼ㄊ莿⒅潜蠼淌谡n題組多年來用于治療神經(jīng)退行性病變的一種特色電針療法，尤其對嗅覺功能障礙具有較好的改善作用。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)鼻灌注LPS的方法建立小鼠PD模型，期望能從病理學(xué)及行為學(xué)角度揭開針刺經(jīng)鼻防治帕金森病的治療思路，為臨床診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級健康雄性C57BL /6 小鼠40只，隨機(jī)分為空白組（Sham），帕金森模型組（Model），帕金森模型+嗅三針干預(yù)組（XSZ），左旋多巴組（L-DOPA），每組10只。

1.2 試劑與儀器 TH免疫組化試劑盒（Sigma公司）；生物素化山羊抗兔IgG（中山金橋生物有限公司）；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威醫(yī)療儀器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 嗅覺障礙模型 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備：健康雄性C57BL/6小鼠，10月齡，體質(zhì)量22～25 g，由西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級飼養(yǎng)，自由飲食1 周。氣體乙醚麻醉小鼠后，將小鼠鼻孔暴露，然后用移液槍將LPS（1 g/L，溶于生理鹽水）少量滴入小鼠鼻孔內(nèi)，防止吸入呼吸道，并盡量使LPS在鼻腔吸收，一側(cè)鼻孔10 μL，2次/d，持續(xù)1月?？瞻捉M滴入同樣體積的生理鹽水[10]。干預(yù)處理完畢后將上述2組大鼠分別放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4 電針及西藥干預(yù)方法 “嗅三針”定位，印堂穴：在小鼠兩眼中點(diǎn)偏上2 mm 處。迎香穴：小鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處。電針方法：所有穴位向內(nèi)上方斜刺0.3 cm。電針參數(shù)：1 mA， 疏密波；正極和負(fù)極各接一側(cè)迎香穴，刺激時(shí)間10 min，1次/d。電針干預(yù)在造模開始后第1天進(jìn)行。5 d為1療程，休息2 d，共進(jìn)行2個(gè)療程。左旋多巴配制：注射液配制成10 mg/mL（左旋多巴10 mg/kg，芐絲肼2.5 mg/kg，溶于0.9%生理鹽水），腹腔注射。

1.5 行為學(xué)指標(biāo)觀察 嗅覺障礙測試方法：改良食物小球埋藏實(shí)驗(yàn)。將食物小球埋藏在墊料中，位置隨機(jī)選擇，深度為1 cm左右。實(shí)驗(yàn)前1 d同一時(shí)間開始，小鼠斷糧不斷水，第2天上午和下午同一時(shí)間分別將實(shí)驗(yàn)小鼠投入實(shí)驗(yàn)場所中，300 s內(nèi)（取2次測試平均值）未找到食物小球的小鼠判定為嗅覺功能失常。

帕金森行為學(xué)評估采用足跡分析及游泳實(shí)驗(yàn)評分方法：1）足跡分析方法：自制50 cm×10 cm×20 cm的通道，用相同尺寸的白紙鋪在通道的底部，首先對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，測量其步長，然后將小鼠后腳掌涂上墨汁，待其穿過通道后，測量小鼠同側(cè)腳印距離，并取平均值。2）游泳實(shí)驗(yàn)方法：將小鼠放入30 cm×20 cm×20 cm的水箱中測試游泳指數(shù)，水深為15 cm，水溫27 ℃。評分標(biāo)準(zhǔn)：3 分，3 min 內(nèi)連續(xù)不斷的游泳； 2 分，大部分時(shí)間游泳； 1 分，偶爾游泳；0 分，四肢無活動。

1.6 組織取材方法 療程結(jié)束后實(shí)施組織取材，參考The Rat Brain嗅球采集方法：采用電鉆在前囟前3.2 mm為后界開窗，使左側(cè)嗅球暴露，繼而從后界垂直插入取出嗅球，留作HE染色用。然后迅速分離腹側(cè)中腦（黑質(zhì)區(qū)及腹側(cè)被蓋區(qū)），按照常規(guī)免疫組化方法處理，留做免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)用。

1.7 大腦黑質(zhì)TH表達(dá)檢測方法 按照常規(guī)免疫組化方法處理，包括載玻片防脫片處理、脫蠟、熱修復(fù)抗原、山羊血清封閉液；滴加1:200的一抗后，4 ℃孵育過夜。次日，PBS洗3次后滴加山羊抗鼠/兔IgG二抗，PBS洗后使用DAB試劑盒顯色；最后至蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片。

1.8 圖像采集 圖像采集應(yīng)用顯微攝像系統(tǒng)，對于采集組織的所有切片，先將其置于100倍鏡下進(jìn)行觀察，其次參照黑質(zhì)組織表達(dá)情況進(jìn)行圖像采集，選取1個(gè)區(qū)域進(jìn)行鏡下400倍觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測定目標(biāo)圖像的平均光密度值，應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s）表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)果 見表1，表2。

表1 各組大鼠嗅覺測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x± s ，n = 10）s

表1表明，在埋藏小球?qū)嶒?yàn)中，與正常對照組相比，LPS組與左旋多巴組小鼠找尋食物的時(shí)間均超過300 s，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可以判定為嗅覺功能減退或喪失。與LPS組比較，“嗅三針”干預(yù)組小鼠找尋時(shí)間減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；左旋多巴組小鼠找尋時(shí)間＞300 s，嗅覺功能障礙未改善。

表2 各組大鼠PD行為學(xué)測試結(jié)果（x± s ，n = 10）

表2表明，在PD行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組相比，LPS組小鼠步長及游泳時(shí)間均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與LPS組比較，“嗅三針”干預(yù)組小鼠步長和游泳的時(shí)間都增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；左旋多巴組小鼠的步長和游泳時(shí)間也得到了改善，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠嗅球病理改變 見圖1。

圖1 各組大鼠嗅球病理改變（×400）

圖1 所示，正常組小鼠嗅球的組織層結(jié)構(gòu)分界清晰，呈同心圓狀整齊排列；而PD模型組嗅球組織層結(jié)構(gòu)分界不清晰，細(xì)胞層排列紊亂，部分細(xì)胞聚集，其中可見炎性細(xì)胞浸潤，與正常組小鼠比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；嗅三針組與模型組相比則顯著降低了炎性細(xì)胞的浸潤，嗅球的顯微結(jié)構(gòu)分界清晰，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左旋多巴組細(xì)胞層排列紊亂，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠黑質(zhì)中TH的表達(dá)（免疫組化染色） 見圖2。

圖2 各組大鼠黑質(zhì)中TH陽性表達(dá)灰度值（IHC×400）

圖2 所示，模型組和空白組比較，黑質(zhì)中TH陽性表達(dá)均顯著低于空白組（P＜0.05），電針嗅三針組顯著提高了TH在中腦黑質(zhì)中的表達(dá)（P＜0.05），左旋多巴組與電針組效果相當(dāng)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

帕金森?。≒D）目前作為臨床常見神經(jīng)退行性疾病，其標(biāo)志是黑質(zhì)紋狀體多巴胺的缺失，以及殘留神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的路易小體（LB）。其主要表現(xiàn)為錐體外系運(yùn)動障礙，表現(xiàn)為肌僵直、靜止性震顫、運(yùn)動遲緩及步態(tài)異常等。有研究[11-12]表明，多巴胺不僅存在于黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)，而且也分布在嗅球等部位，所以有許多帕金森病患者不僅患有嗅覺障礙，而且有可能會早于運(yùn)動癥狀出現(xiàn)。筆者在動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LPS在引起帕金森病運(yùn)動癥狀的同時(shí)也會導(dǎo)致嗅覺障礙，而早期針灸干預(yù)的介入不僅可以改善嗅覺行為障礙，還可以對PD行為學(xué)障礙有改善作用。

脂多糖（LPS）作為自然界中存在的物質(zhì)，常會被空氣中的污染物質(zhì)裹挾，經(jīng)過鼻腔避開血腦屏障后，進(jìn)入腦內(nèi)從而誘發(fā)PD。研究[13]證明，LPS經(jīng)鼻暴露不僅能觸發(fā)嗅覺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，還會使嗅覺神經(jīng)元丟失，這可能是PD患者早期嗅覺減退的重要誘因。另外，研究顯示，導(dǎo)致鼻炎的感染源也會釋放更多的LPS，這些原因可能都會增加PD的發(fā)病概率。酪氨酸羥化酶（TH）是一種重要的限速酶，這種兒茶酚胺類物質(zhì)可以合成多巴胺，因?yàn)镻D病程進(jìn)展與多巴胺含量密切相關(guān)，所以有研究[14-16]認(rèn)為，TH陽性神經(jīng)元的含量與PD病情呈正相關(guān)。從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，小鼠長期鼻飼LPS誘導(dǎo)的PD模型導(dǎo)致腦黑質(zhì)部分TH神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，早期通過“嗅三針”療法可以阻止減少的發(fā)生，這可能也是“嗅三針”針刺療法干預(yù)PD早期的機(jī)制之一。