下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p對(duì)外周血單核細(xì)胞的影響

顏雯 鐘文清 許曉雙 胡桂芳 楊美蘭 程佳

動(dòng)脈粥樣硬化是多因素共同參與的血管壁的慢性炎癥性疾病, 亦是腦卒中、冠心病、周?chē)芗膊〉牟±砩砘A(chǔ),可對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害［1］。動(dòng)脈粥樣硬化的病理顯示,氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)識(shí)別、吞噬以及泡沫細(xì)胞形成中單核-巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵性和特征性尤為突出, 并對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮著重要作用［2］。MV是多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的膜囊泡, 表面蛋白具有抗原性, 易被多種受體細(xì)胞識(shí)別, 因其能轉(zhuǎn)移來(lái)源細(xì)胞相關(guān)的DNA、蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA的能力而被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊、信息傳遞的有效載體［3］。研究表明［4］, MV與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系密切, 其攜帶的miRNA可對(duì)靶細(xì)胞mRNA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控, 其中miRNA-199a-3p與單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)相關(guān)。本次研究通過(guò)對(duì)下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p的檢測(cè), 并探討其對(duì)外周血單核細(xì)胞的影響, 具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年6月在本院就診的下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者(實(shí)驗(yàn)組)和健康體檢者(對(duì)照組), 各60例, 取外周血標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組患者的入選標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前影像學(xué)檢查［下肢血管彩超或CT血管成像(CTA)］確診下肢動(dòng)脈有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊并血管狹窄的患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝腎功能不全者、惡性腫瘤及孕婦患者。實(shí)驗(yàn)組男36例, 女24例；年齡40～78歲, 平均年齡(66.9±5.2)歲。對(duì)照組男34例, 女 26例；年齡40～80歲, 平均年齡(67.2±4.8)歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。新鮮血管組織標(biāo)本取自1例在本院就診的下肢動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥患者的截肢遠(yuǎn)端血管, 以其截肢近端血管作為對(duì)照。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-199a-3p表達(dá)水平檢測(cè) ①血管組織：取新鮮血管組織標(biāo)本, 分別提取總RNA, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用莖環(huán)引物的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA-199a-3p水平。②MV：磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶7的比例加入外周血中進(jìn)行稀釋, 100000 r/min離心, 2 h, 棄上清液, 沉淀為抽提的MV, PBS懸浮, -80℃保存, 以上述同樣方法進(jìn)行miR-199a-3p檢測(cè)。③外周血單核細(xì)胞：6%右旋糖酐溶液加入新鮮外周血, 靜置60 min, 上層液置入其他試管 , 加 入 Hank’s液 (無(wú) Mg2+、Ca2+), 混勻 , 2000 r/min 離心, 10 min, 棄上清液, 洗滌2次；以CD68為單核細(xì)胞標(biāo)志物, 分選并留取單核細(xì)胞, 以同樣方法檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)水平。

1.2.2 單核細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇取自液氮罐中的人單核細(xì)胞T THP-1凍存管, 采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸, 并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 5% CO2、溫度37℃,離心后傳代或換液, 維持細(xì)胞“單個(gè)、亮、圓”的懸浮狀態(tài)。細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 分設(shè)miRNA-199a-3p inhibitor組、miRNA-199a-3p mimics組、空白對(duì)照組, 各組設(shè)復(fù)孔6個(gè),轉(zhuǎn)染 miRNA-199a-3p inhibitor、miRNA-199a-3p mimics、FuGENE, 靜置15 min, 置入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng), 5% CO2、37℃, 3 d后提取RNA濃度及質(zhì)量。采用超微量分光光度儀對(duì)提取的RNA 濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè), miR-199a-3p表達(dá)水平經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.3 趨化因子檢測(cè) 各組單核細(xì)胞提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 采用PCR檢測(cè)MCP-1、RANTES、Fractalkine。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-199a-3p表達(dá)水平

2.1.1 血管組織內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

2.1.2 外周血單核細(xì)胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組外周血單核細(xì)胞、MV中的miRNA-199a-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.3 外周血單核細(xì)胞各組miRNA-199a-3p 表達(dá)水平miRNA-199a-3p inhibitor組外周血單核細(xì)胞中的miRNA-199a-3p表達(dá)水平低于空白對(duì)照組, miRNA-199a-3p mimics組外周血單核細(xì)胞中的miRNA-199a-3p表達(dá)水平高于空白對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 單核細(xì)胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達(dá)水平 檢測(cè)Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達(dá)水平, miRNA-199a-3p inhibitor組高于空白對(duì)照組, miRNA-199a-3p mimics組低于空白對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。見(jiàn)圖 1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周血單核細(xì)胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平比較

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周血單核細(xì)胞、MV內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較, ap＜0.05

組別 例數(shù) 單核細(xì)胞 MV實(shí)驗(yàn)組 60 0.89±0.11a 6.29±1.22a對(duì)照組 60 0.34±0.09 3.06±0.60

表2 外周血單核細(xì)胞各組 miRNA-199a-3p 表達(dá)水平比較( x-±s)

圖1 外周血單核細(xì)胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達(dá)水平

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是個(gè)多細(xì)胞多因子參加的血管慢性炎癥過(guò)程, 其中單核巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)活化后粘附于血管內(nèi)皮并遷徙至內(nèi)膜下而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞, 進(jìn)而釋放大量的促炎因子加重局部的炎癥反應(yīng), 是動(dòng)脈粥樣硬化的病變發(fā)展的第一步。miRNA-199a-3p在19號(hào)染色體p13.2的DNM2基因16號(hào)內(nèi)含子內(nèi), 主要在胃癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),而近期有研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可抑制上述炎癥反應(yīng), 并減少泡沫細(xì)胞的形成, 而且發(fā)現(xiàn)部分預(yù)后良好的動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中含miRNA-199a-3p的外泌體濃度偏高, 在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中miRNA-199a-3p有著重要影響［5,6］。本研究結(jié)果顯示, 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p表達(dá)水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組外周血單核細(xì)胞、MV中的miRNA-199a-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。進(jìn)一步證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)的miRNA-199a-3p可通過(guò)MV形式分泌入外周血, 被單核細(xì)胞吞噬并產(chǎn)生影響。此外, 由于趨化因子RANTES、Fractalkine、MCP-1與泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成密切相關(guān)［7,8］, Fractalkine是CX3C家族趨化因子, 與受體CX3CR1結(jié)合, 在動(dòng)脈粥樣硬化中具促炎作用；MCP-1對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖具有趨化和促進(jìn)作用；RANTES與CCR5結(jié)合作用于T細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及單核細(xì)胞上, 可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成［9,10］。本研究發(fā)現(xiàn), 外周血單核細(xì)胞經(jīng)miRNA-199a-3p inhibitor和miRNA-199a-3p mimics成功轉(zhuǎn)染后, miRNA-199a-3p表達(dá)水平分別上調(diào)、抑制, 同時(shí), miRNA-199a-3p對(duì)外周血單核細(xì)胞內(nèi)的Fractalkine、RANTES、MCP-1表達(dá)具有抑制作用。因此, 推測(cè)miRNA-199a-3p能夠抑制上述動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。

總之, 下肢動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)miRNA-199a-3p水平高表達(dá), 其以MV形式分泌至外周血中, 對(duì)單核細(xì)胞中的趨化因子表達(dá)具有抑制作用, 是動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)因素。