復(fù)方多糖的葡聚糖凝膠分離及純度鑒定

□ 鄭亞玲 新疆水產(chǎn)科學(xué)研究所（新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心）

多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中，是一類(lèi)天然高分子化合物，其在抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗?jié)?、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等方面有良好的應(yīng)用前景[1]。

凝膠色譜[2]又稱(chēng)分子篩色譜，凝膠柱色譜法常用的凝膠有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，可使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離[3]。多糖是極性大分子化合物，具有分子量、組成、聚合度、分子形狀不均一的特點(diǎn)[4]。測(cè)定多糖純度的方法有功能團(tuán)分析、比旋光度、水解后糖組分分析、紙色譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜法和高效液相色譜、超離心和高壓電泳、超離心分析法等[2]。

1 檢測(cè)方法

1.1 紙色譜法

紙色譜法[5]是以濾紙作為載體，讓樣品溶液在濾紙上展開(kāi)。紙色譜的溶劑由有機(jī)溶劑和水組成，當(dāng)有機(jī)溶劑和水部分溶解時(shí)則有兩種可能——一相是以水飽和的有機(jī)溶劑相，一相是以有機(jī)溶劑飽和的水相。紙色譜中的流動(dòng)相是指層析液在毛細(xì)拉力作用下能不斷由下向上流動(dòng)，固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具有親水性，故使這部分水束縛在纖維素周?chē)?，不易擴(kuò)散而成為固定相。在層析過(guò)程中，當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下上升，流經(jīng)色素濾液細(xì)線時(shí)，濾液細(xì)線上的色素就相繼溶入層析液，隨著層析液上升發(fā)生再分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)不同，那些分配系數(shù)大的色素分子隨層析液向上移動(dòng)得快，形成的色素帶集中在濾紙上部；而分配系數(shù)小的色素分子，隨層析向上移動(dòng)得慢，形成的色素帶集中在濾紙下面。

1.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法

一種純物質(zhì)在一定條件、一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，它的吸收光譜是一定的。根據(jù)物質(zhì)吸收光譜最大吸收峰波長(zhǎng)的位置或吸收峰形狀和數(shù)量，可以判斷該物質(zhì)的純度。對(duì)于某些生物大分子（如核酸和蛋白質(zhì)），可以根據(jù)他們?cè)谧贤夤鈪^(qū)的特征吸收峰波長(zhǎng)（如核酸260nm，蛋白質(zhì)280nm）處測(cè)得吸光值，可通過(guò)求二者吸光值的比值來(lái)判斷純度。

1.3 凝膠色譜法

凝膠色譜也可用于多糖的純度鑒定——若經(jīng)凝膠色譜得到單一對(duì)稱(chēng)峰，說(shuō)明該多糖為均一組分。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

儀器：電子天平、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、超聲波清洗器、電熱真空干燥箱、層析柱（3cm×100cm）、層析缸（7cm×25cm）。

試劑：葡聚糖凝膠、磷酸、正丁醇、丙酮、醋酸、氯化鈉、濃硫酸、苯酚、苯胺、鋅粉等（均為分析純?cè)噭?/p>

原料：復(fù)方多糖樣品（已經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂初步分離）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 多糖的分離純化

3.1.1 裝柱、平衡

稱(chēng)取葡聚糖干粉20.0g，在90℃蒸餾水中溶脹5h。溶脹平衡后，在凝膠顆粒面上加較多的水，用攪棒將凝膠攪勻，放置數(shù)分鐘，將沉降很慢的細(xì)顆粒隨上層水到掉，如此反復(fù)至上層沒(méi)有細(xì)顆粒為止。向洗好的凝膠中加入2倍凝膠體積的NaCl溶液，放置于80℃水中加熱30～40min以排除凝膠溶液中的氣泡，同時(shí)，另取200mL同濃度的NaCl溶液在80℃水中加熱以排除溶液中的氣泡，以備裝柱時(shí)用。

除完氣泡后，選長(zhǎng)為100.0cm、外徑為3.0cm的層析柱開(kāi)始裝柱。將除好氣泡的200mL NaCl溶液倒入柱中，再將已做好的薄棉花片鋪于柱底，把凝膠溶液攪勻倒進(jìn)柱中，待柱底面上積起約1～2cm的凝膠床后，打開(kāi)柱的出口，隨著下面水的流出上面不斷加入凝膠，并不斷輕敲四周柱壁，使形成的凝膠床面上有均勻連續(xù)的凝膠降下，得到均勻的凝膠柱。裝好凝膠柱后，量算出有效柱體積，用3～5倍柱體積的NaCl溶液平衡凝膠柱。

3.1.2 上樣、洗脫

取0.1g樣品溶于0.1mol?L-1的NaCl溶液中，使其體積為柱體積的0.5%，將凝膠柱層面上的洗脫液放出至距床面小于0.5mm時(shí)，用移液管將配制好的樣品溶液逐滴加在床面上，使樣品溶液均勻平鋪在凝膠床面上，待樣品溶液完全進(jìn)入凝膠柱后，向床面上緩緩加上10cm高的洗脫液，再逐滴加入洗脫液進(jìn)行洗脫，使加入洗脫液的速度與凝膠柱流速相等。

計(jì)算凝膠柱流速及每分鐘流出的體積，每流出3mL收集一次，至流出液呈無(wú)色為止，停止收集。再分別用0.2mol?L-1、0.3mol?L-1、0.4mol?L-1、0.5mol?L-1NaCl溶液重復(fù)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟。

3.1.3 洗脫劑濃度的選擇

分別取收集的各瓶樣品溶液0.1mL，再依次加入1.0mL 5%苯酚、0.9mL蒸餾水和5.0mL濃硫酸，放置20min顯色后，在490nm下測(cè)其吸光度，并繪制吸收曲線，根據(jù)吸收曲線選擇最佳的洗脫劑濃度（實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖表1～5）。

3.2 純度鑒定

3.2.1 紫外光譜法

用電光天平稱(chēng)取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0201g，配制成100mL溶液。取配制好的多糖溶液3.5mL、蒸餾水3.5mL，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400nm范圍內(nèi)每10nm測(cè)一次吸光度（實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6）。

3.2.2 凝膠色譜法

取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.1g溶于7mL 0.2mol?L-1NaCl溶 液 中， 上SephadexG-200層 析 柱(3.0×60cm)，用0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫，流速為54s/滴，分步收集，每30min收集一次，至流出液呈無(wú)色為止，停止收集，用苯酚-硫酸法檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7、圖6）。

3.2.3 紙層析法

稱(chēng)取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0502g，加入10mL蒸餾水配成0.5%多糖溶液，濾紙尺寸為(4cm×23cm)，以正丁醇：乙醇：水＝4:1:5為展開(kāi)劑，室溫展開(kāi)6h，苯胺磷酸鹽為顯色劑，100℃，顯色10min。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 洗脫效果與討論

表1 0.1mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖1 0.1mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表2 0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖2 0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表3 0.3mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖3 0.3mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表4 0.4mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖4 0.4mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表5 0.5mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖5 0.5mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

由圖1、圖2、圖3、圖4、圖5可以看出，以0.2mol?L-1NaCl溶液為洗脫劑所得的曲線峰形及對(duì)稱(chēng)性較好，因此可確定用葡聚糖凝膠分離復(fù)方免疫增強(qiáng)劑中多糖的最佳洗脫劑為0.2mol?L-1的NaCl溶液。

4.2 純度鑒定結(jié)果與討論

表6 紫外光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖6 凝膠色譜法純度鑒定洗脫曲線

4.2.1 紫外光譜法

由以上數(shù)據(jù)可以看出，在260nm和280nm處樣品無(wú)吸收峰，說(shuō)明此多糖樣品中不含蛋白質(zhì)和核酸。

表7 凝膠色譜法純度鑒定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4.2.2 凝膠色譜法

由以上數(shù)據(jù)和圖形可以看出，得到的曲線是單一對(duì)稱(chēng)峰，說(shuō)明此多糖樣品為均一組分。

4.2.3 紙層析

經(jīng)顯色烘干后可見(jiàn)濾紙上只有一個(gè)斑點(diǎn)，可說(shuō)明此多糖樣品為均一組分。

5 結(jié)論

以0.2mol?L-1的NaCl溶液為洗脫劑，使用Sephadex G-200可有效分離純化復(fù)方免疫增強(qiáng)劑中多糖，達(dá)到最佳分離效果。

經(jīng)紫外光譜法、凝膠色譜法、紙層析法、旋光度法鑒定，由Sephadex G-200分離純化出的復(fù)方多糖為均一組分。