桂花OfCCD1基因啟動(dòng)子克隆與表達(dá)特性

劉玉成，王藝光，張 超，董 彬，付建新，胡紹慶，趙宏波

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江理工大學(xué) 建筑工程學(xué)院，浙江 杭州310018）

類胡蘿卜素是廣泛分布于自然界的一類色素，迄今已發(fā)現(xiàn)了近800種［1］，主要存在于植物的葉、花、果實(shí)和根等器官中，在吸引昆蟲、鳥類傳播花粉和種子中發(fā)揮作用［2］。類胡蘿卜素可作為多種生物活性物質(zhì)的前體，經(jīng)過氧合酶或非酶裂解作用可以形成阿樸類胡蘿卜素［3］，后者及其衍生物可生成β-紫羅蘭酮（β-ionone）等香氣物質(zhì)及脫落酸（abscisic acid，ABA）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［4］。作為類胡蘿卜素裂解氧合酶（carotenoid cleavage oxygenases，CCO）中的重要成員，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶1（carotenoid cleavage dixoygenase 1，CCD1）在不同的植物中所裂解的底物、作用位點(diǎn)不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)［5］，CCD1在C9～C10（C9′～C10′）位時(shí)剪切番茄紅素、胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)或脫輔基類胡蘿卜素等，形成β-紫羅蘭酮， β-環(huán)檸檬醛（β-cyclocitral）， 香葉基丙酮（geranylacetone）和假紫羅蘭酮（pseudoionone）等芳香類物質(zhì)；在番茄紅素 C5～C6（C5′～C6′）位裂解時(shí)則形成 6-甲基-5-庚烯-2-酮［6］， 認(rèn)為 CCD1 對(duì)基于類胡蘿卜素代謝途徑的香氣物質(zhì)合成發(fā)揮著重要作用。桂花Osmanthus fragrans在中國(guó)栽培歷史悠久，集綠化、美化和香化為一體，花香和花色是其重要觀賞性狀。類胡蘿卜素裂解雙加氧酶1（OfCCD1）［7］降解桂花中的著色物質(zhì)——α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素［8］，合成主要香氣物質(zhì)α-紫羅酮和β-紫羅酮［9］?；騿?dòng)子控制著基因在特定的組織［10］、特定的發(fā)育階段［11］以及一定的環(huán)境條件下表達(dá)［12］；分離相關(guān)基因啟動(dòng)子，分析其序列及其作用元件，并研究其功能，可明確該基因的調(diào)控因子及其作用機(jī)制。本研究利用染色體步移技術(shù)克隆了OfCCD1啟動(dòng)子，通過啟動(dòng)子序列分析、載體構(gòu)建和瞬時(shí)表達(dá)分析，初步明確了其功能，為揭示OfCCD1基因調(diào)控花色花香代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為6～8年生地栽丹桂品種 ‘堰虹桂’ ‘Yanhong Gui’，栽植于浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃。

1.2 主要試劑

Taq聚合酶、限制酶（DraⅠ，EcoRⅤ，PvuⅡ，StuⅠ），質(zhì)粒載體PMD18-T，大腸埃希菌Escherichia coliDH5α，膠回收試劑盒，DNA片段純化試劑盒和無縫連接試劑盒均購自Takara公司（大連）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 參照十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）提取 ‘堰虹桂’基因組DNA［13］。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) ‘堰虹桂’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的CCD1序列（GenBank登錄號(hào)MG138152）［14］和 BALDERMANN 等發(fā)表的OfCCD1（GenBank登錄號(hào) AB526197.1）序列［9］， 用 Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)下游特異性引物1（GSP1），特異性引物2（GSP2）和特異性引物4（GSP4）；利用上述2段序列的重復(fù)序列設(shè)計(jì)特異性引物3（GSP3）；利用接頭引物1（AP1）與GSP1，接頭引物2（AP2）與GSP2經(jīng)2輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）獲得的啟動(dòng)子片段設(shè)計(jì)特異性引物5（GSP5）。利用pBI121質(zhì)粒上的β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucosidase，GUS）基因序列設(shè)計(jì)上游引物GUS-F和下游引物GUS-R。引物及接頭均由上海生工合成（表1）。

1.3.3 DNA文庫的構(gòu)建、擴(kuò)增 ①DNA文庫的構(gòu)建。分別用DraⅠ，EcoRV，PvuⅡ，StuI 4種限制性內(nèi)切酶對(duì)提取到的DNA進(jìn)行酶切。酶切體系為基因組DNA 25.0 μL（100 mg·L-1），限制內(nèi)切酶8.0 μL， 10×限制酶 buffer 10.0 μL， 滅菌水 57.0 μL， 總體積 100.0 μL，37 ℃過夜。 取 5.0 μl酶切產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)。按照DNA純化試劑盒的說明書對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化后加接頭。分別取4組酶切純化的DNA各4.8 μL，染色體步移接頭GWA 1.9 μL，10×連接緩沖液0.8 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，16.0℃過夜；70.0℃水浴5 min，加入32.0 μL去離子水。② 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。取AP1， 引物 GSP1/GSP3， 模板各 1.0 μL， 預(yù)混合Taq酶 10.0 μL， 去離子水補(bǔ)至 20.0 μL進(jìn)行第 1輪PCR。擴(kuò)增程序?yàn)?4.0℃ 5 min；94.0℃ 25 s，72.0℃ 3 min，7循環(huán)；94.0℃ 25 s，65.0℃ 3 min，32循環(huán)；67.0℃ 7 min。取第1輪產(chǎn)物1.0 μL并稀釋50倍作為第2輪PCR的模板。第2輪PCR體系為：AP2，GSP2/GSP4/GSP5，模板各1.0 μL，預(yù)混合Taq酶10.0 μL，去離子水補(bǔ)至20.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4.0℃ 5 min；94.0℃ 25 s，72.0℃ 3 min，5循環(huán)；94.0℃ 25 s，65.0℃ 3 min，20循環(huán)；67.0℃ 7 min。取GUS-F，GUS-R和pBI121質(zhì)粒各1.0 μL，預(yù)混合Taq酶10.0 μL，去離子水補(bǔ)至20.0 μL進(jìn)行GUS序列擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5.0℃5 min；95.0℃30 s，69.8℃30 s，72.0℃1 min，35循環(huán)；72.0℃10 min；4.0℃10 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 OfCCD1啟動(dòng)子克隆所用引物Table 1 Primer sequences used in the cloning of OfCCD1 promoters

1.3.4 PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化鑒定及序列測(cè)定與分析 切膠回收按照MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa，大連）的說明書進(jìn)行。載體連接按照PMD18-T載體說明書（Takara，大連）進(jìn)行，連接后的重組質(zhì)粒導(dǎo)人大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在50 mg·L-1氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落菌液PCR檢測(cè)后將陽性克隆送公司測(cè)序。序列初步分析采用DNAMAN軟件進(jìn)行。啟動(dòng)子序列作用元件分析采用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行。

1.3.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)分析 根據(jù)獲得的OfCCD1的啟動(dòng)子序列，利用Takara（http：//www.clontech.com）無縫連接引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3對(duì)無縫連接引物CCD1P-S-F和CCD1P-S-R，CCD1P-L-F和CCD1P-L-R，GUS-F和GUS-R。具體操作步驟按照Takara無縫連接試劑盒的說明書進(jìn)行。將重組好的表達(dá)載體利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciensGV3101感受態(tài)。隨后將煙草Nicotiana tabacum葉片剪切成0.5 cm×0.5 cm的葉塊，在農(nóng)桿菌菌液吸光度D（600）為0.6的侵染液中浸染10 min；無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將侵染的外植體移至于無菌水浸潤(rùn)的濾紙上培養(yǎng)24 h并進(jìn)行GUS染色，37℃下保溫16～24 h。V（乙酸）∶V（乙醇）=3∶1的混合液脫色后取出，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子克隆

以 ‘堰虹桂’DNA為模板，分別利用引物GSP1和GSP2，接頭引物AP1和AP2進(jìn)行2輪PCR，在EcoR文庫擴(kuò)增得到條帶；經(jīng)比對(duì)和拼接得到長(zhǎng)度為511 bp的序列（圖1A）。利用引物GSP3和GSP4，接頭引物AP1和AP2經(jīng)過2輪PCR，在DraI文庫中得到約2 000 bp的條帶（圖1B）。測(cè)序后，經(jīng)比對(duì)和拼接得到長(zhǎng)度為2 747 bp的條帶，命名為OfCCD1P-L（圖2）。利用GSP3和GSP5經(jīng)過2輪PCR后在PvuⅡ文庫中得到750 bp左右的條帶（圖1B），經(jīng)過拼接比對(duì)得到OfCCD1上游981 bp的啟動(dòng)子序列，命名為OfCCD1P-S（圖 3）。

2.2 啟動(dòng)子序列分析

利用PlantCARE網(wǎng)站對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，OfCCD1P-L有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同時(shí)有7個(gè)響應(yīng)元件，響應(yīng)茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸、乙烯的元件，以及熱激元件，鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒癌基因同源物（MYB）結(jié)合位點(diǎn)，并有4個(gè)響應(yīng)脫落酸（ABA）的核心序列ACGT（表2）。OfCCD1P-S中含有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同時(shí)有3個(gè)光響應(yīng)元件，1個(gè)熱激響應(yīng)元件以及1個(gè)ABA響應(yīng)元件（表3），并有4個(gè)ABA響應(yīng)元件（ABRE）核心序列ACGT。

圖1 OfCCD1啟動(dòng)子克隆電泳圖Figure 1 PCR products of OfCCD1 promoters

表2 OfCCD1P-L中順式作用元件Table 2 Cis-acting elements in OfCCD1P-L

2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)分析

將克隆得到的啟動(dòng)子和GUS片段分別與pBI121質(zhì)粒進(jìn)行重組（圖4），以含GUS∶∶GUS表達(dá)載體的菌株為陰性對(duì)照（ck1），以含pBI 121載體菌株為陽性對(duì)照（ck2），對(duì)構(gòu)建的OfCCD1P-L∶∶GUS和OfCCD1P-S∶∶GUS表達(dá)載體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析（圖5）。從圖5可以看出，陰性對(duì)照沒有著色，陽性對(duì)照著色范圍和程度最好，OfCCD1P-L∶∶GUS表達(dá)載體和OfCCD1P-S∶∶GUS表達(dá)載體均有著色，但著色都比陽性對(duì)照要弱。

3 討論

圖2 OfCCD1P-L序列Figure 2 Sequence of OfCCD1P-L

圖3 OfCCD1P-S序列Figure 3 Sequence of OfCCD1P-S

表3 OfCCD1P-S中順式作用元件Table 3 Cis-acting elements in OfCCD1P-S

桂花OfCCD1基因有2個(gè)拷貝［14］。在啟動(dòng)子克隆過程中，第1次步移并未得到足夠長(zhǎng)的序列。目前，已報(bào)道的OfCCD1序列有2個(gè)：ZHANG等［14］發(fā)現(xiàn)的CCD1序列（GenBank登錄號(hào)MG138152）和 BALDERMANN發(fā)表的OfCCD1序列（GenBank登錄號(hào)AB526197.1）［9］。 本研究利用上述2個(gè)序列的重復(fù)序列設(shè)計(jì)了引物GSP3，并在GSP3 5′上游設(shè)計(jì)了GSP4，利用已獲得的部分OfCCD1啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)了引物GSP5，分別步移從而獲得了OfCCD1P-S和OfCCD1P-L的啟動(dòng)子序列。其中OfCCD1P-L長(zhǎng)度為2 747 bp，OfCCD1P-S長(zhǎng)度為981 bp。原因是OfCCD1啟動(dòng)子區(qū)域的2個(gè)拷貝所含酶切位點(diǎn)不同，構(gòu)建文庫時(shí)OfCCD1P-L啟動(dòng)子區(qū)域被內(nèi)切酶截?cái)嗟膮^(qū)域短，步移得到的啟動(dòng)子就較長(zhǎng)；而OfCCD1P-S啟動(dòng)子區(qū)域大部分被截?cái)?，所得的啟?dòng)子序列就較短。類似地，已報(bào)道的CCD家族其他成員的啟動(dòng)子長(zhǎng)度也有差異，如擬南芥Arabidopsis thaliana的AtCCD7［10］和AtNCED2［15］，花生Arachis hypogaea的AhNCED1［16］啟動(dòng)子都有 2 000 bp 左右， 而菊花Chrysanthemum morifolium的CmCCD4a-5［17］和桂花的OfCCD4［18］啟動(dòng)子則分別為 1 094 bp和 1 337 bp。 上述文獻(xiàn)中進(jìn)行啟動(dòng)子克隆所用方法不盡相同，這也是造成獲得啟動(dòng)子長(zhǎng)度不一的因素。

圖4 OfCCD1的2個(gè)啟動(dòng)子重組質(zhì)粒圖Figure 4 Recombinant vectors of two OfCCD1

圖5 瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)Figure 5 Detection of transient expression

本研究所獲得的2個(gè)OfCCD1啟動(dòng)子所含元件種類是具有一致性的，都含有光響應(yīng)元件、熱激響應(yīng)元件和ABA響應(yīng)元件，其中較多的是光響應(yīng)元件。在桂花中，OfCCD1的表達(dá)受光照影響［9］，證實(shí)了OfCCD1啟動(dòng)子中的光響應(yīng)元件的存在。同一個(gè)亞家族的其他成員，如CCD4［19］和CCD2［20］的啟動(dòng)子中也發(fā)現(xiàn)了光響應(yīng)元件。這表明光響應(yīng)元件在CCD家族的啟動(dòng)子中可能是普遍存在的。不過功能上可能有差異，因?yàn)樵诓丶t花Crocus sativus中，CsCCD2的表達(dá)是受光抑制的［20］。

此外，克隆得到的2個(gè)啟動(dòng)子中含有4個(gè)ACGT序列［21］。ACGT是啟動(dòng)子中一個(gè)重要的順式作用元件，該序列可以響應(yīng)水楊酸（salicylic acid，SA），紫外線，ABA和茉莉酸（jasmonic acid，JA）［22］的處理。有研究表明：響應(yīng)ABA至少需要2個(gè)ACGT序列，且2個(gè)ACGT之間的堿基數(shù)不同，響應(yīng)的激素種類也不同。MEHROTRA等［23］的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)2個(gè)ACGT序列之間的距離是5 bp時(shí)，這段序列響應(yīng)SA的處理；當(dāng)距離是25 bp時(shí)，該序列響應(yīng)ABA處理。在堿蓬Suaeda salsa［24］和大豆Glycine max［25］中ABA處理會(huì)使CCD1的表達(dá)量升高，因此，桂花中OfCCD1的表達(dá)極有可能響應(yīng)ABA的誘導(dǎo)，具體的響應(yīng)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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