核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表達(dá)分析

高向倩，李憶林，賈彩霞，李大培，楊玉婷，楊桂燕

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院 山陽(yáng)核桃板栗試驗(yàn)示范站，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院 陜西省經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是一個(gè)多功能的二聚體酶超家族，具有解毒、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧等功能［1］。在植物中，GSTs根據(jù)其功能和序列等特征被分為8個(gè)亞家族：alpha，mu，pi，sigma，theta，kappa，zeta 和線粒體（microsomal）GSTs［1－3］。 目前， 很多植物中的GST基因被陸續(xù)克?。?-5］， 并進(jìn)行功能研究， 發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同植物的GST同源基因或相同植株的不同GST基因，其功能具有一定差異。大多數(shù)GSTs基因具有響應(yīng)逆境脅迫的功能。如前期研究發(fā)現(xiàn)，檉柳Tamarix hispida的zeta家族基因ThGSTZ1能被氯化鈉，聚乙二醇（PEG 6000），脫落酸（ABA）和甲基紫精（MV）等脅迫調(diào)控，過量表達(dá)情況下能提高轉(zhuǎn)基因株系抵抗鹽、旱、MV及ABA等脅迫的能力［6－7］。核桃Juglans regia的JrGSTTau1基因也能響應(yīng)不同逆境刺激，過量表達(dá)能改善植株應(yīng)對(duì)低溫脅迫的能力［8］。在羽衣甘藍(lán)Brassica oleracea中分離獲得65個(gè)GST基因，其中BoGSTU19，BoGSTU24，BoGSTF10能被冷脅迫強(qiáng)誘導(dǎo)，推測(cè)它們與冷脅迫響應(yīng)具有重要關(guān)系［9］。水稻Oryza sativa OsGSTl2轉(zhuǎn)基因擬南芥Arabidopsis thaliana表現(xiàn)出較高的重金屬耐受力［10］。這些研究表明：GST基因在植物響應(yīng)逆境應(yīng)答及調(diào)節(jié)中具有多方面的作用，因此具有重要的研究?jī)r(jià)值。GST家族成員眾多，目前對(duì)GST基因的研究主要集中在草本植物，對(duì)木本植物GST基因的研究較少，特別是經(jīng)濟(jì)干果核桃鮮見報(bào)道。核桃屬多年生落葉喬木，是中國(guó)主要經(jīng)濟(jì)樹種之一。近年來(lái)全球環(huán)境的變化，環(huán)境因子特別是西北地區(qū)越冬入春出現(xiàn)的 “倒春寒”及夏秋核桃成熟期嚴(yán)重的高溫干旱等氣候現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，篩選核桃逆境響應(yīng)重要基因，研究其逆境響應(yīng)功能機(jī)制，將對(duì)了解核桃的逆境適應(yīng)機(jī)制具有指導(dǎo)作用。本研究從核桃中鑒定獲得1條GST基因JrGSTU23，通過生物信息及定量表達(dá)分析其生物學(xué)功能，以期為核桃抗逆響應(yīng)研究提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

選取培養(yǎng)于相同條件下的2年生 ‘香玲’ ‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。處理包括非生物脅迫［100 g·kg-1聚乙二醇（PEG 6000）， 0.3 mol·L－1氯化鈉、 低溫 6 ℃］和激素處理［0.1 mmol·L－1脫落酸（ABA）］， 100.0 mg·L－1茉莉酸（MeJA）及 2.0 mg·L－1水楊酸（SA）。 分別在 0， 3， 6， 12， 24， 48 h 取樣，以0 h正常澆水作為對(duì)照，重復(fù)3次·處理－1。分別收集各處理后的根和葉，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 JrGSTU23基因的克隆與分析

以 “glutathione transferase”為關(guān)鍵詞在 ‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找GST基因，經(jīng)BLAST比對(duì)選取其中1條GST基因（命名為JrGSTU23）進(jìn)行分析。用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定JrGSTU23基因開放讀碼框（ORF），再根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R（表1），進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD-18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coliDH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，對(duì)獲得目的片段的克隆測(cè)序。利用Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)確認(rèn)的JrGSTU23基因序列特征進(jìn)行分析。利用BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進(jìn)行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0軟件對(duì)不同物種的GST蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化分析。使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該基因啟動(dòng)子中含有的順式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模，推測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。

表1 研究所用引物Table 1 The used primers

1.3 JrGSTU23的表達(dá)分析

各樣品總核糖核酸（RNA）采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取［8］，RNA經(jīng)DNA消化酶處理后采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（CWBIO，康為世紀(jì)，中國(guó)）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的模板。qRT-PCR參照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）進(jìn)行，內(nèi)參基因?yàn)楹颂?18S rRNA（HE574850）基因［10］。JrGSTU23定量引物為 DL-F和 DL-R（表1）。 定量反應(yīng)儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的Step OneTMReal-Time PCR System。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性12 s，60℃退火45 s，72℃延伸 45 s，45個(gè)循環(huán)；81℃讀板 1 s， 重復(fù)3次·樣品－1。 采用 2-ΔΔCt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行相對(duì)分析［11］，所有表達(dá)值均做了以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 JrGSTU23全長(zhǎng)cDNA序列分析

通過查找核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得1條GST基因，根據(jù)獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)引物JrGSTU23-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因ORF長(zhǎng)684 bp，擬推導(dǎo)的蛋白分子量為25.89 kDa，含有氨基酸數(shù)為227，理論等電點(diǎn)為5.20。BLAST分析發(fā)現(xiàn)：該基因與核桃轉(zhuǎn)錄組中的GST23基因相同。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白具有GST-Tau保守域（圖1），表明該蛋白屬于GST氧硫還蛋白亞家族（thioredoxin-line superfamily，Thi），因此命名為JrGSTU23（GeneBank登錄號(hào)：MG356784）。經(jīng)美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）同源搜索獲得相似蛋白，并進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)JrGSTU23蛋白與香蕉Musa accuminata，毛果楊Populus trichocarpa等的進(jìn)化關(guān)系較近（圖2）。通過Swiss Model程序同源建模，推測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖3所示。

2.2 JrGSTU23啟動(dòng)子分析

以JrGSTU23在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)其與 ‘強(qiáng)特勒’核桃的GST序列（XM_018974105.1）一致。因此，分析XM_018974105.1序列起始密碼子上游2 000 bp的DNA序列作為基因啟動(dòng)子，并對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析，為預(yù)測(cè)JrGSTU23基因的功能及可能調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。PlantCARE預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，JrGSTU23啟動(dòng)子包含多個(gè)與逆境響應(yīng)及激素調(diào)控相關(guān)的順式作用元件，如熱脅迫響應(yīng)元件（HSE），干旱響應(yīng)元件（MBS），茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif），水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）等（表 2）。

2.3 外源激素脅迫對(duì)JrGSTU23表達(dá)的影響

對(duì)試材分別進(jìn)行ABA，MeJA，SA等激素處理。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：JrGSTU23能被這些激素明顯誘導(dǎo)，但在根和葉的表達(dá)趨勢(shì)不同（圖4）。在葉中，ABA處理3～6 h被抑制，24 h達(dá)最大表達(dá)水平（2.85）；MeJA脅迫下與ABA相反，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，JrGSTU23的表達(dá)水平逐漸下降，在24 h被抑制（－0.98）；SA脅迫3～6 h也被抑制，在24 h達(dá)最大值4.13，但其最低值出現(xiàn)在3 h，為－0.01。在根中，JrGSTU23在ABA脅迫下的最大和最小轉(zhuǎn)錄水平分別出現(xiàn)在12和24 h，分別為4.35和2.74；MeJA處理下，該基因的最大和最小表達(dá)量分別為7.24（12 h）和2.73（3 h）；而在SA脅迫下，JrGSTU23的表達(dá)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，最大值為4.57倍（24 h）。表明JrGSTU23基因能不同程度響應(yīng)ABA，Me-JA，SA的脅迫，并表現(xiàn)出組織特異性，但其具體的響應(yīng)機(jī)制可能不同。

2.4 不同非生物脅迫對(duì)JrGSTU23基因表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示：JrGSTU23能被氯化鈉，聚乙二醇（PEG 6000），6℃等不同脅迫明顯誘導(dǎo)，且在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)下的表達(dá)差異顯著（圖4）。氯化鈉脅迫下，JrGSTU23在根和葉中的表達(dá)趨勢(shì)相似，均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增高，在脅迫24 h達(dá)最大表達(dá)水平，分別為2.49和4.11。但除3 h外，其他處理點(diǎn)該基因在根中的表達(dá)水平高于在葉中的表達(dá)。PEG 6000模擬干旱脅迫3～12 h，JrGSTU23在葉中的表達(dá)被抑制，24 h被誘導(dǎo)為1.76；在根中的表達(dá)趨勢(shì)與氯化鈉脅迫相似，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增大，且在24 h達(dá)最高水平，但表達(dá)量低于氯化鈉脅迫。表明JrGSTU23應(yīng)對(duì)氯化鈉和干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制可能相似，但JrGSTU23對(duì)鹽脅迫可能更為敏感。低溫脅迫下，JrGSTU23在葉中的表達(dá)在6 h（1.22）和24 h（2.30）出現(xiàn)2個(gè)高峰；在根中，其表達(dá)趨勢(shì)與氯化鈉和干旱脅迫相似，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在24 h 達(dá)最大值（3.06）。

圖1 JrGSTU23蛋白與其同源蛋白序列的氨基酸聚類分析Figure 1 Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species

圖2 JrGSTU23蛋白與其他物種相似蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 2 Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species

圖3 JrGSTU23蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Figure 3 Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23

表2 PlantCARE預(yù)測(cè)JrGSTU23啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件Table 2 Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE

圖4 JrGSTU23基因在不同脅迫處理下的表達(dá)水平Figure 4 Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses

3 討論

GSTs是植物響應(yīng)逆境的重要基因，在植物解毒等方面具有重要作用。其中，含有Tau保守結(jié)構(gòu)域的GST亞家族基因，參與植物眾多的逆境響應(yīng)。核桃作為中國(guó)西北地區(qū)扶貧攻堅(jiān)項(xiàng)目的重要經(jīng)濟(jì)樹種，在推動(dòng)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展上具有重要作用。核桃產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展與核桃產(chǎn)量和質(zhì)量息息相關(guān)。但氣候等環(huán)境因子嚴(yán)重制約了中國(guó)核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，選育抗逆優(yōu)良核桃品種，掌握核桃抗逆適應(yīng)機(jī)制，對(duì)深入了解核桃的適應(yīng)性具有重要指導(dǎo)作用。本研究從 ‘香玲’核桃中克隆獲得1條Tau家族的GST基因（JrGSTU23），經(jīng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因與來(lái)自水稻、香蕉、毛果楊、大豆Glycine max等物種的Tau家族基因具有較近的親緣關(guān)系，推測(cè)其可能與這些蛋白具有相似或相近的功能。如，水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化劑和過氧化氫誘導(dǎo)，表明Osgstu4和Osgstu3的應(yīng)答反應(yīng)涉及氧化還原反應(yīng)［12］。大豆GmGSTU2-2是嚴(yán)格的滲透脅迫型響應(yīng)基因，參與植物脅迫反應(yīng)中的催化和調(diào)節(jié)功能網(wǎng)絡(luò)［13］。毛果楊的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotoluene）誘導(dǎo)［14］。因此，推測(cè)JrGSTU23與逆境應(yīng)答具有重要關(guān)系。

順式作用元件一般由5～20個(gè)堿基對(duì)組成，是同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列［15］。海蓬子Salicornia brachiata的一個(gè)Tau類GST基因的上游1 023 bp啟動(dòng)子包含有非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的ABA響應(yīng)元件（ABRE），干旱響應(yīng)基因rd22識(shí)別位點(diǎn)（MYB），結(jié)節(jié)特意表達(dá)元件（NOD），光響應(yīng)表達(dá)元件（GATA），光調(diào)控表達(dá)元件（GT1）及激素、病害和損傷等相關(guān)的順式作用元件，參與了該基因響應(yīng)氯化鈉和滲透脅迫的表達(dá)調(diào)控［16］。玉米Zea mays的ZmCIPK10和ZmZIP71基因啟動(dòng)子序列中含有ABA，SA，赤霉素（GA），低溫等相關(guān)的順式作用元件，在氯化鈉、干旱、低溫脅迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71的表達(dá)量上升，表明其參與了玉米的逆境響應(yīng)［17－18］。本研究發(fā)現(xiàn)：JrGSTU23基因啟動(dòng)子含有豐富的順式作用元件，如玉米素代謝、種子調(diào)控、分生組織激活、胚乳表達(dá)以及干旱脅迫、熱脅迫、防衛(wèi)、MeJA和SA等響應(yīng)相關(guān)的元件（表2）。由此可推測(cè)，JrGSTU23可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)過程，具有深入研究的價(jià)值。

GSTs基因響應(yīng)逆境具有組織表達(dá)特異性。本研究發(fā)現(xiàn)的JrGSTU23基因在不同激素（SA，MeJA，ABA）及不同逆境（氯化鈉、干旱、低溫）下在根和葉中能被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)，體現(xiàn)了一定的組織表達(dá)特異性和逆境響應(yīng)特異性。這與其他物種的Tau家族GST基因的逆境響應(yīng)表達(dá)具有一定的相似性。如從香蕉克隆獲得的5個(gè)GST基因（MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3，MaGSTF1，MaGSTL1）的表達(dá)具有組織特異性，在鹽、干旱、冷等脅迫下Tau亞家族的MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3的表達(dá)受鹽、干旱、冷誘導(dǎo)更為明顯，而MaGSTF1和MaGSTL1更受信號(hào)分子影響［19］，預(yù)測(cè)這些GST基因?qū)Σ煌婢车捻憫?yīng)功能具有差異。鹽脅迫下，番茄Solanum lycopersicum的SlGSTU23和SlGSTU26基因在葉中被上調(diào)表達(dá)［20］，推測(cè)這些GST基因在不同逆境下的具體功能可能不同。JrGSTTau1在低溫脅迫下也表現(xiàn)出根、葉表達(dá)差異，過表達(dá)提高了植株的抗寒能力［8］?？梢?，通過分析基因響應(yīng)不同逆境的轉(zhuǎn)錄水平，可以推測(cè)其在逆境響應(yīng)中可能的生物學(xué)功能。JrGSTU23能不同程度地響應(yīng)激素及非生物脅迫，表明其參與了核桃的逆境響應(yīng)調(diào)控。后續(xù)研究將通過在植株中過量表達(dá)全面分析JrGSTU23基因的抗逆響應(yīng)功能。

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