香港四照花外植體的抗褐化處理與誘導培養(yǎng)

陳夢倩，范李節(jié)，王小德

（浙江農(nóng)林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州311300）

香港四照花Dendrobenthamia hongkongensis是山茱萸科Cornaceae四照花屬Dendrobenthamia常綠喬木，自然分布于華東、華南、西南等地區(qū)。主干通直，冠型飽滿；初夏頭狀花序頂生，花苞片大而潔白，觀賞性強；秋季核果聚生成球形，紅艷可愛，既可食用又可釀酒、入藥［1-2］。四照花屬的大部分植物種子都具有深休眠的特性，影響了優(yōu)良種質(zhì)資源的有性繁殖和推廣［3］。植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種成熟的擴繁技術(shù)，不僅能保持繁殖體的優(yōu)良特性，且繁殖速度快，周期短，不受場地、環(huán)境限制，是苗木良種化、工廠化的重要途徑［4］。因此，進行香港四照花的誘導培養(yǎng)研究，對香港四照花的擴繁和推廣應(yīng)用具有現(xiàn)實意義。香港四照花在初代培養(yǎng)中極易褐化，會影響外植體的誘導與生長，嚴重時能致其死亡，故對它進行抗褐化研究顯得尤為重要。目前，常用的抗褐化措施有預處理材料，選擇適宜的培養(yǎng)條件，使用抗褐化劑等［5］。其中，常用抗褐化劑主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP），活性炭（AC），抗壞血酸（VC）， 硫代硫酸鈉（Na2S2O3）及檸檬酸（CA）等［6］。 劉均利等［7］發(fā)現(xiàn) PVP 對華蓋木 Manglietiastrum sinicum外植體的抗褐化效果顯著。李萍等［8］研究表明，在培養(yǎng)基中加入2.0 g·L－1AC培養(yǎng)4 d再轉(zhuǎn)入不含AC的培養(yǎng)基中，能有效控制牡丹Paeonia suffruticosa外植體褐化。本研究選擇香港四照花嫩葉、莖段和帶芽莖段為外植體，通過不同消毒方式處理、篩選基本培養(yǎng)基、材料預處理和使用抗褐化劑等方法，以期得出能有效降低香港四照花外植體褐化率的最佳方案，并采用正交試驗法，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對外植體誘導的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為浙江農(nóng)林大學校園的香港四照花，于2017年3月中旬至5月中旬，選擇生長健壯、無病蟲害的當年生嫩葉、莖段和帶芽莖段作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 所有基本培養(yǎng)基若無特殊說明均為木本植物用培養(yǎng)基（woody plant medium，WPM）， 添加蔗糖 30.0 g·L－1， 瓊脂 6.0 g·L－1， 除植物生長調(diào)節(jié)劑配比試驗外， 均附加 1.0 mg·L－16 芐基腺嘌呤（6-BA）+0.2 mg·L－1萘乙酸（NAA）， pH 5.8。 各試驗中 3 種外植體均接種 20 瓶·處理-1， 3 個·瓶－1，重復 3 次·處理－1。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照時間 12 h·d－1， 光照強度 1 800～2 000 lx， 接種后先暗培養(yǎng)7 d再進行光培養(yǎng)。

1.2.2 外植體的消毒處理 將采集的3種外植體用流水沖洗并用軟毛筆刷去表面臟物，放在洗潔精溶液中浸泡5 min，流水沖洗1 h。瀝干水后，在超凈工作臺上先用體積分數(shù)為70%乙醇消毒30 s，用無菌水漂洗 3 次后，分別用 2 種消毒劑處理： 30.0 mL·L－1次氯酸鈉（NaClO）溶液（5， 10，15 min）和 1.0 g·L－1氯化汞（HgCl2）溶液（5，8，10 min），消毒后用無菌水漂洗5遍。切除與消毒液接觸的傷口部位，將嫩葉切成1.0 cm×1.0 cm大小，莖段和帶芽莖段切成1.0～1.5 cm長，接種于培養(yǎng)基上。每日觀察統(tǒng)計污染率和存活率。

1.2.3 基本培養(yǎng)基的篩選 采用1.2.2篩選出的最佳消毒方式處理的3種外植體，分別接種在MS（Murashige and Skoog），DKW（Driver and Kuniyuki），WPM培養(yǎng)基上。每日觀察統(tǒng)計褐化率及誘導率。

1.2.4 外植體抗褐化預處理 將流水沖洗1.0 h后的外植體分別置于1.0 g·L－1PVP，1.0 g·L－1檸檬酸和1 g·L－1VC中浸泡3.0 h，以未預處理為對照（ck），浸泡后將3種外植體置于超凈工作臺上消毒并接種。每日觀察統(tǒng)計褐化率。

1.2.5 抗褐化劑實驗 在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的 PVP（0.5，1.0，2.0 g·L－1）， 檸檬酸（0.5，1.0，2.0 g·L－1）， VC（0.5， 1.0， 2.0 g·L－1）， 活性炭（0.5， 1.0， 2.0 g·L－1）和硫代硫酸鈉（0.1， 0.2， 0.5 g·L－1），以不添加任何抗褐化劑為對照（ck），將3種外植體接種到各培養(yǎng)基中。每日統(tǒng)計外植體褐化率。

1.2.6 植物生長調(diào)節(jié)劑配比試驗 采用正交試驗設(shè)計L9（34），在WPM培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度6-BA（0.5， 1.0， 2.0 mg·L－1）， NAA（0， 0.1， 0.2 mg·L－1）和 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D， 0.1， 0.2， 0.5 mg·L－1），接種后每日觀察并記錄外植體啟動時間，統(tǒng)計出愈率及萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

在接種后第30天統(tǒng)計各處理的數(shù)據(jù)。用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 19.0進行方差分析。污染率=（形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；褐化率=（外植體褐化數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；存活率=（存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；誘導率=（誘導數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；出愈率=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；萌發(fā)率=（誘導出芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對外植體污染率及存活率的影響

3種外植體消毒處理結(jié)果表明（表1）：隨著消毒時間延長，3種外植體污染率都有顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合30 d后統(tǒng)計的存活率（圖1B），1.0 g·L-1氯化汞溶液消毒5 min為最佳消毒時間，嫩葉污染率僅為33.89%，莖段、帶芽莖段分別為25.00%和27.78%，3種外植體之間差異顯著（P＜0.05）。用30.0 mL·L-1次氯酸鈉溶液消毒的外植體褐化情況較輕，但自培養(yǎng)第4天起不斷出現(xiàn)污染，污染率較高，且存活率較低（圖1A）。

表1 不同消毒藥劑及時間對3種外植體污染率的影響Table 1 Effects of different disinfectants and time on the contamination rate of 3 explants

圖1 不同消毒藥劑及時間處理下的3種外植體存活率Figure 1 Survival rate of 3 explants treated with different disinfectants and time

2.2 不同基本培養(yǎng)基對外植體褐化及誘導的影響

將3種外植體接種于MS，DKW和WPM等 3種不同基本培養(yǎng)基，結(jié)果表明（表2）：接種于WPM培養(yǎng)基的3種外植體褐化率均低于接種于MS和WPM培養(yǎng)基的褐化率，嫩葉、莖段和帶芽莖段的褐化率分別是67.8%，60.0%和61.7%。試驗中發(fā)現(xiàn)莖段與嫩葉經(jīng)誘導產(chǎn)生愈傷組織，帶芽莖段經(jīng)誘導易萌發(fā)出新芽，其中接種于WPM培養(yǎng)基的外植體生長狀況最好，誘導率最高。WPM與其他2種培養(yǎng)基的外植體褐化率與誘導率均差異顯著（P＜0.05），故以WPM培養(yǎng)基為最適基本培養(yǎng)基。

2.3 不同抗褐化劑預處理對外植體褐化率的影響

表 3 表明：采用 1.0 g·L－1PVP，1.0 g·L－1VC 和 1.0 g·L－1檸檬酸浸泡 3 h 的外植體褐化率都有所下降，其中1.0 g·L－1PVP預處理后的外植體褐化率最低，與對照（ck）差異顯著（P＜0.05）。3種外植體經(jīng)1.0 g·L－1PVP預處理后，莖段褐化率為33.3%，顯著低于嫩葉褐化率（50.6%）和帶芽莖段褐化率（38.9%）（P＜0.05）。

表2 不同基本培養(yǎng)基對外植體褐化及誘導的影響Table 2 Effects of different basic culture medium on the browning rate and induction rate of explants

表3 不同抗褐化劑預處理對3種外植體褐化率的影響Table 3 Effects of pretreatment with different anti browning agents on the browning rate of 3 explants

2.4 不同抗褐化劑及質(zhì)量濃度對外植體褐化率的影響

以未添加抗褐化劑為對照（ck），在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的PVP，檸檬酸和VC后，3種外植體褐化率均低于ck（表4），且與ck差異顯著（P＜0.05）。添加0.5 g·L－1活性炭后，外植體褐化情況顯著下降（P＜0.05），但若培養(yǎng)基活性炭質(zhì)量濃度過高，反而加重外植體褐化。在培養(yǎng)基中添加了不同質(zhì)量濃度的硫代硫酸鈉，3種外植體褐化率隨質(zhì)量濃度上升而上升。由表4得知：2.0 g·L－1PVP為莖段和帶芽莖段的最佳抗褐化劑，其褐化率分別為13.3%和16.7%，與其他抗褐化劑有顯著的差異（P＜0.05）。嫩葉的最佳抗褐化劑為1.0 g·L－1檸檬酸，褐化率為27.4%。嫩葉褐化率與莖段、帶芽莖段褐化率差異性顯著（P＜0.05），莖段與帶芽莖段之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對外植體誘導的影響

由6-BA，NAA和2,4-D的極差（R）可知：嫩葉與莖段愈傷組織誘導的主因素分別為2,4-D（11.30）和NAA（20.52）（表 5）。 葉片誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組合為 WPM+1.0 mg·L－16-BA+0.2 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－12,4-D，出愈率為58.3%，8 d葉片四周產(chǎn)生愈傷組織（圖2A）。莖段與葉片啟動時間相近，7 d基部膨大并長出少量愈傷組織（圖2B），其最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D，出愈率為75.4%，與其他處理間存在顯著差異（P＜0.05）。

由不同因素的極差（R）可知（表6）：影響帶芽莖段誘導的主因素為6-BA。經(jīng)Tukey s-b分析可知：7號和4號處理與其他處理有顯著差異（P＜0.05），其萌發(fā)率分別為76.7%和72.8%。故帶芽莖段誘導新芽的最佳組合為 WPM+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D， 萌發(fā)時間為 8 d（圖 2C）。

3 結(jié)論與討論

褐化現(xiàn)象制約著木本植物組織培養(yǎng)的發(fā)展，本試驗采用單因素試驗法，從不同消毒方式、基本培養(yǎng)基、外植體預處理方式、抗褐化劑等4個方面進行研究，尋找降低香港四照花褐化率的有效途徑。結(jié)果表明：外植體采用1.0 g·L-1氯化汞消毒5 min存活率最高。這與路承香等［9］的研究結(jié)果一致，與唐佳佳等［3］在狹葉四照花Dendrobenthamia angustata的研究結(jié)果不一致，可能因其選用1年生幼苗更易滅菌。3種外植體接種于WPM培養(yǎng)基中褐化率最低，誘導率相對較高，生長狀況最好。推測原因為WPM培養(yǎng)基無機鹽總含量較低，減輕了外植體褐變［10］。想從根本上解決組織培養(yǎng)中外植體褐化的問題，還需從分子、遺傳等角度對其外植體進行更深入的研究。

表4 不同抗褐化劑及質(zhì)量濃度對3種外植體褐化率的影響Table 4 Effects of different concentrations of anti browning agents on the browning rate of 3 explants

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導的影響Table 5 Effects of different hormone kinds and concentrations on callus induction

PVP為專一吸附酚類物質(zhì)的常用吸附劑，能阻止酚類物質(zhì)被氧化為醌類物質(zhì)，可降低外植體褐化程度。檸檬酸通過抑制多酚氧化酶的活性來抑制褐化［11］。本研究發(fā)現(xiàn)：在接種前用1.0 g·L-1PVP浸泡香港四照花外植體能有效降低褐化率，在培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1PVP能明顯減輕莖段與帶芽莖段的褐化現(xiàn)象。嫩葉在添加1.0 g·L－1檸檬酸的培養(yǎng)基中褐化率最低，但檸檬酸遇高溫會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，影響培養(yǎng)基凝固，故需高壓滅菌后用注射器加入，不利于工廠化生產(chǎn)。硫代硫酸鈉與檸檬酸活性炭褐化效果不明顯，甚至在高質(zhì)量濃度下加重了外植體褐化。這與在核桃楸Juglans mandshurica［12］和黑莓Rubus［13］上的研究結(jié)論不一致，可能因選用基本培養(yǎng)基不同，也可能是不同樹種差異性所致。

表6 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對帶芽莖段誘導的影響Table 6 Effects of different hormone kinds and concentrations on the induction of stem segment with bud

圖2 3種外植體的誘導培養(yǎng)Figure 2 Induction of 3 explants

不同的外植體類型對該種植物的誘導培養(yǎng)有很大的影響。試驗結(jié)果表明：莖段是誘導愈傷組織的最佳外植體，而帶芽莖段誘導屬腋芽萌發(fā)，污染率及褐化率較低，最易萌發(fā)產(chǎn)生新芽；葉片褐化率較高，出愈率低于莖段，可能因其分化程度較高；試驗中發(fā)現(xiàn)少數(shù)帶芽莖段會在切口處長出奶黃色愈傷組織，但不影響帶芽莖段繼續(xù)萌發(fā)，故本試驗只統(tǒng)計其萌發(fā)率。

植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體的形態(tài)建成及其調(diào)控起著重要作用。本試驗將組織培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用的3種植物生長調(diào)節(jié)劑組合使用，以期尋找最佳誘導培養(yǎng)基。結(jié)果表明：嫩葉最佳植物生長調(diào)節(jié)劑組合為：1.0 mg·L－16-BA+0.2 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－12,4-D； 莖段與帶芽莖段的最佳激素組合均為： 2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－12,4-D。通過對正交試驗結(jié)果的直觀分析，2,4-D和NAA對嫩葉、莖段誘導愈傷組織的影響較大，而6-BA在誘導腋芽萌發(fā)具有突出的促進作用［14］。

4 參考文獻

［1］ 韋直，何業(yè)祺.浙江植物志：第3卷［M］．杭州：浙江科學技術(shù)出版社，1993：388－389.

［2］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第56卷［M］．北京：科學出版社，1990.

［3］ 唐佳佳，劉翠玉，尚旭嵐，等.狹葉四照花莖段的離體培養(yǎng)與植株再生［J］.中國農(nóng)學通報，2014，30（22）：79－83.TANG Jiajia， LIU Cuiyu， SHANG Xulan，et al.In vitro culture and plant regeneration from stem segments ofDen-drobenthamia angustata［J］.Chin Agric Sci Bull,2014,30（22）：79-83.

［4］ 胡愛雙，趙玉輝，劉鎮(zhèn)東，等.優(yōu)良榛資源快繁體系的建立與優(yōu)化［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2015，46（4）：476-480.HU Aishuang， ZHAO Yuhui， LIU Zhendong，et al.Establishment and optimization of rapid propagation system of elite hazelnut resources ［J］.J Shenyang Agric Univ,2015,46（4）：476-480.

［5］ 謝志亮，吳振旺.木本植物組培褐化研究進展［J］.中國南方果樹，2013，42（5）：42-46.XIE Zhiliang， WU Zhenwang， Advances in browning of woody plants in tissue culture ［J］.South China Fruits,2013,42（5）：42-46.

［6］ 呂宗友，蘇衍菁，趙國琦，等.不同防褐化措施對蘇丹草愈傷誘導以及抗褐化的效果研究［J］.草業(yè)學報，2011,20（3）： 174-181.Lü Zongyou， SU Yanqing， ZHAO Guoqi，et al.Effect of anti-browning agent on the sudangrass callus ofSorghum sudanense［J］.Acta Pratacult Sin,2011,20（3）：174-181.

［7］ 劉均利，馬明東.華蓋木組織培養(yǎng)中褐化控制研究［J］.浙江林業(yè)科技，2007，27（1）：20-23,32.LIU Junli， MA Mingdong.Study on browning of ehdangeredManglietiastrum sinicumin tissue culture ［J］.J Zhejiang For Sci Technol,2007,27（1）：20-23,32.

［8］ 李萍，成仿云，張穎星.防褐劑對牡丹組培褐化發(fā)生、組培苗生長和增殖的作用［J］.北京林業(yè)大學學報，2008， 30（2）： 71-76.LI Ping， CHENG Fangyun， ZHANG Yingxing.Effects of browning antagonists on antibrowning,growth and multiplication of tissue culture of tree peony ［J］.J Beijing For Univ,2008,30（2）：71-76.

［9］ 路承香，李仲芳，王有科，等.峨眉四照花莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（4）：1416-1418.LU Chengxiang， LI Zhongfang， WANG Youke，et al.Preliminary discussion on tissue culture technology for the stem-tip in the rare and protected plantDendrobenthamia japonicavar.emeinsi［J］.J Anhui Agric Sci,2008,36（4）：1416-1418.

［10］ 邱璐，陳善娜，夏躍明，等.桑樹組織培養(yǎng)中褐化問題的研究［J］.云南大學學報（自然科學版），2000，22（1）： 76-78.QIU Lu， CHEN Shanna， XIA Yueming，et al.Study on browning in tissue culture ofMorus albaL.［J］.J Yunnan Univ,2000,22（1）：76-78.

［11］ 彭思佳，丁力，劉清波，等.抗褐化劑對荻外植體褐化和愈傷組織生長的影響［J］.草原與草坪，2015,35（5）：7-11,16.PENG Sijia， DING Li， LIU Qingbo，et al.Effect of antioxidant on explant browning and callus growth ofMiscanthus sacchariflorus［J］.Grassland Turf,2015,35（5）：7-11,16.

［12］ 張建瑛，祁永會，呂躍東，等.核桃楸腋芽再生體系研究［J］.植物研究，2015，35（1）：22-26.ZHANG Jianying， QI Yonghui， Lü Yuedong，et al.Regeneration system for axillary bud ofJuglans mandshuricaMaxim.［J］.Bull Bot Res,2015,35（1）：22-26.

［13］ 王小敏，吳文龍，李海燕，等.黑莓外植體褐化影響因素分析及適宜培養(yǎng)條件篩選［J］.植物資源與環(huán)境學報，2009， 18（3）： 63-68.WANG Xiaomin， WU Wenlong， LI Haiyan，et al.Analysis of influence factor on browing of blackberry explants and selection of suitable culture condition ［J］.J Plant Resour Environ,2009,18（3）：63-68.

［14］ 葉潤燕，童再康，張俊紅，等.樟樹莖段組培快繁［J］.浙江農(nóng)林大學學報，2016，33（1）：177-182.YE Runyan， TONG Zaikang， ZHANG Junhong，et al.Tissue culture and rapid propagation for stems ofCinnamomum camphora［J］.J Zhejiang A&F Univ,2016,33（1）：77-182.