鹽酸克侖特羅快速定量檢測(cè)試劑條研制（時(shí)間分辨微球法）

宋文 何魯江

目前，一般檢測(cè)鹽酸克侖特羅的快速診斷試劑條采用的方法是膠體金檢測(cè)法，該方法雖然能滿足快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，但是只能定性判斷樣品的陰、陽(yáng)性，而時(shí)間分辨微球檢測(cè)試劑條可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速定量檢測(cè)。時(shí)間分辨熒光微粒是將鑭系稀土元素Eu3+、Tb3+等填入高分子納米微粒內(nèi)制成。將其用于免疫分析中，則是將蛋白共價(jià)交聯(lián)在納米微球表面的化學(xué)基團(tuán)上，通過(guò)免疫反應(yīng)和待檢物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度來(lái)推算待檢物的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽(yáng)性尿樣、陰性尿樣、時(shí)間分辨微球（長(zhǎng)沙特優(yōu)異）、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化學(xué)試劑（購(gòu)自Sigma）。鹽酸克侖特羅單克隆抗體、鹽酸克侖特羅BSA偶聯(lián)物（購(gòu)自杭州隆基生物）。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（湘儀）、超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝）、旋轉(zhuǎn)混合儀（寧波新芝）、時(shí)間分辨讀卡儀（蘇州和邁）。

1.3 方法

1.3.1 鹽酸克侖特羅的標(biāo)記時(shí)間分辨微球

1.3.1.1 配置標(biāo)記使用的緩沖液

Buffer A：50mM MES溶液（pH6.0）;

Buffer B：0.23% Tris+0.25% casein（pH8.0）;

Buffer C：0.76% Borax（pH9.0） ;

Buffer D：0.76% Borax+0.25% Casein。

1.3.1.2 微球標(biāo)記抗體

①100μL直徑200nm的時(shí)間分辨微球，原始濃度1%（W/V），稀釋到900μL Buffer A中;

②15000rpm離心20min，去上清;

③加入1000μL Buffer A，使用移液槍吹打混勻;

④15000rpm離心20min，去上清;

⑤加入1000μL Buffer C，超聲2min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定10℃寧波新芝JY92-IIN，2號(hào)變幅桿）;

⑥配置50mg/mL EDAC溶液（使用純化水溶解），配置50mg/mL NHS溶液（使用純化水溶解），以上溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

⑦在稀釋、超聲好的1000μL微球溶液（0.1%W/V）中加入10μL EDAC溶液以及20μL NHS溶液，震蕩混勻（旋渦混勻器）5min后，再用旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻25min（室溫條件）;

⑧15000rpm離心20min，去上清;

⑨加入1000μL Buffer C，使用移液槍吹打混勻后超聲2min（功率65%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

⑩15000rpm離心20min，去上清;

?加入700μL Buffer C，使用移液槍吹打混勻后超聲2min（功率65%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?使用Buffer C稀釋需要標(biāo)記的蛋白（抗體0.1mg、重組抗原0.2mg），在旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻2h（室溫條件）;

?加入100μL Buffer D，旋渦震蕩勻混2min，在旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻30min（室溫條件）;

?15000rpm離心15min，去上清;

?加入1000μL Buffer B使用移液槍吹打混勻，超聲1min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?15000rpm離心15min，去上清;

?加入1000μL Buffer B使用移液槍吹打混勻，超聲1min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?超聲完畢的微球保存在2～8℃冰箱中。

1.3.2 試紙的制作

將標(biāo)記好的微球抗體使用Buffer B稀釋100倍，分裝于反應(yīng)杯中（每個(gè)反應(yīng)杯裝量300μL），并進(jìn)行鋁塑封膜。該組件作為檢測(cè)抗體反應(yīng)液體。將鹽酸克侖特羅BSA偶聯(lián)物劃膜在硝酸纖維素膜（賽多利斯CN140）上，使用濃度為0.2mg/mL;質(zhì)控線包被濃度為1.0mg/mL羊抗鼠多抗，兩者的劃膜噴量為1.0μL/mL。按照正常組裝方式分別將PVC塑料底板、硝酸纖維素膜（25mm）、空氣濾膜（17mm）黏貼組裝。

1.3.3 試紙條檢測(cè)

將鹽酸克侖特羅使用陰性尿樣稀釋，建立梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度值分別為0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。

使用反應(yīng)杯自帶的10μL采樣頭分別吸取不同濃度值的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品，插入到反應(yīng)杯中顛倒混勻5次，并滴加3滴混合液到試紙條的加樣孔中，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品重復(fù)10個(gè)測(cè)試，一個(gè)80個(gè)測(cè)試。計(jì)時(shí)5min后將試劑條放入時(shí)間分辨讀卡儀中檢測(cè)原始信號(hào)值。并記錄相應(yīng)結(jié)果，并進(jìn)行曲線擬合。

2 結(jié)果與討論

使用OriginPro 8擬合軟件計(jì)算擬合曲線以及分析相關(guān)系數(shù)，

計(jì)算模型使用：y=A2+（A1-A2）/（1+（x/x0）^p）。

計(jì)算賦值如下：

A1：229.43258;A2：0.04056;X0：0.02722;P：1.06004;

擬合曲線R2為0.99。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明時(shí)間分辨熒光的理化性質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①由于Eu3+等被納米微粒包裹，消除了在水溶液中熒光淬滅的危險(xiǎn)（Eu3+在水中不穩(wěn)定）;

②由于每個(gè)納米微粒里可以包裹上萬(wàn)個(gè)Eu3+，因而能放大免疫反應(yīng)效果;

③應(yīng)用在免疫分析中，操作更加簡(jiǎn)便：只需要共價(jià)交聯(lián)時(shí)間分辨熒光微粒和抗原抗體，在免疫反應(yīng)后無(wú)需加入解離增強(qiáng)液便可讀數(shù)。

與膠體金等傳統(tǒng)的快診方法相比，時(shí)間分辨微球法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①可準(zhǔn)確定量;

②定量檢測(cè)范圍更寬，信噪比更高;

③分析的靈敏度高——時(shí)間分辨熒光免疫層析分析儀的檢測(cè)器采用的是PMT光電倍增管，比起傳統(tǒng)儀器用的硅光電池的靈敏度更高;

④精密度高——傳統(tǒng)的試紙條由5部分構(gòu)成，吸水墊+NC膜+結(jié)合墊+樣品墊+濾血片;而時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條則是由3部分構(gòu)成，吸水墊+NC膜+多功能濾膜，因而CV值更小，精密度更高。