2017年北京地區(qū)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康狀況的病理學(xué)調(diào)查和分析*

宋銀娟 張茜茜 陳合花 廖 軼 段玉涵 吳 偉 孫 欣 王 璐 徐宏偉 姚 嬌 董浩迪 楊利峰 趙德明 周向梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指在一定條件下人工飼養(yǎng)繁殖，具有特定的生物學(xué)特性，用于科學(xué)研究的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命科學(xué)研究中起著不可替代的作用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[1]。因而，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況在生命科學(xué)研究中至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)室自2009年以來每年都對(duì)北京地區(qū)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行病理學(xué)調(diào)查和分析。2017年5月對(duì)北京市16 家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位的共330只嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要器官、組織進(jìn)行樣品采集，組織切片制作，HE染色，部分組織進(jìn)行了油紅O和PAS染色，然后進(jìn)行病理學(xué)觀察和統(tǒng)計(jì)分析。調(diào)查結(jié)果顯示所抽檢的330例嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體處于健康狀態(tài)，但也有個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)肝臟脂肪變性、肝臟局灶性壞死、肺萎陷、 小腸嗜酸性粒細(xì)胞增多及脾臟陳舊性出血等病變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2017年5月，由中國(guó)食品藥品檢定研究院從北京市16家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位分別抽取一定數(shù)量的SPF級(jí)、清潔級(jí)的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和普通級(jí)豚鼠四種實(shí)驗(yàn)用鼠進(jìn)行調(diào)查和分析，具體情況見表1。

表1 2017年5月嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采樣情況Table 1 Classification of samples of laboratoryrodents in May 2017 只

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織切片的制備和觀察: CO2窒息處死動(dòng)物，采集動(dòng)物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸。經(jīng)甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定后按常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPUS U-SRG數(shù)碼顯微鏡觀察并采圖。

1.2.2肝臟油紅O染色：對(duì)HE染色觀察中有中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品， 抽取部分樣品進(jìn)行油紅 O 染色。主要步驟為： 組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛 + 1% 氯化鈣)固定一周， 肝臟組織制作冰凍切片，油紅 O 染色，50%乙醇脫色，蘇木素復(fù)染核，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.3肝臟PAS 染色:同時(shí)對(duì)HE染色觀察出現(xiàn)中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品進(jìn)行PAS 染色。主要步驟為:甲醛鈣液固定，制作肝組織石蠟切片，高碘酸氧化，Schiff 氏試劑染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)鼠肝臟病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

2.1.1鏡下變化：顯微鏡觀察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)鼠肝臟以細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的腫脹變性為主，另有一例小鼠出現(xiàn)肝臟局灶性壞死。與正常肝臟(圖1 A)相比，肝細(xì)胞腫脹樣本鏡下可見肝細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)有大小不等、呈圓形或橢圓形的空泡，有的空泡融合在一起，胞核被擠向一側(cè)；也可見部分腫脹的肝細(xì)胞胞漿內(nèi)呈顆粒狀，中央靜脈和肝血竇可見紅細(xì)胞(圖1B、C)。肝臟壞死樣本鏡下可見壞死區(qū)域肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞胞核固縮、溶解、消失，胞漿淡染；部分壞死區(qū)域出現(xiàn)大量紅細(xì)胞。壞死區(qū)域周圍有少量呈圓形、細(xì)胞核藍(lán)染的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。

對(duì)肝細(xì)胞腫脹樣本進(jìn)行油紅 O 染色,經(jīng)顯微鏡觀察油紅 O 染色陽(yáng)性的切片可見肝細(xì)胞輪廓和由蘇木素藍(lán)染的細(xì)胞核，胞漿內(nèi)可見大量大小不一的圓形紅色脂滴，有的圍繞在細(xì)胞核周圍，有的聚集呈大脂滴(圖2A)。病變肝臟同時(shí)進(jìn)行 PAS 染色，陽(yáng)性樣本可見肝細(xì)胞胞核周圍有紫紅色顆粒物質(zhì)異常沉積，與未著色部分形成明顯對(duì)比(圖2B)。

2.1.2病變情況統(tǒng)計(jì): 病理學(xué)觀察結(jié)果顯示在140例小鼠樣本中，肝臟異常以細(xì)胞腫脹為主，經(jīng)油紅O染色檢出脂肪變性2例，PAS染色確診糖原沉積6例，另出現(xiàn)1例肝臟局灶性壞死。肝臟病變檢出率6.4%。這可能與飼養(yǎng)環(huán)境和飼料不達(dá)標(biāo)有關(guān)。大鼠肝細(xì)胞腫脹變性程度總體較嚴(yán)重，50例大鼠樣本中，經(jīng)油紅O染色檢出4例脂肪變性，病變率8%。120例豚鼠樣本中，經(jīng)油紅染色確診脂肪變性6例，PAS染色確診糖原沉積5例；其中，有2例SPF級(jí)豚鼠肝臟既有脂肪變性又有糖原沉積，肝臟病變率7.5%。20例金黃地鼠樣本肝臟均未見明顯病變。

圖1 肝臟HE染色(×40)注: A: 正常對(duì)照; B: 肝細(xì)胞腫脹; C: 肝臟空泡變性; D: 肝臟壞死灶Fig.1 Pathological changes of liver (HE ×40)Note: A: Normal liver; B: Hepatocellular swelling; C: Vacuolar degeneration; D: Focal necrosis

圖2 肝臟變化情況注: A: 肝臟油紅 O 染色陽(yáng)性(×100); B: 肝臟 PAS 染色陽(yáng)性(×40)Fig.2 Pathological changes of liverNote: A: Adipose degeneration (Oil Red-O staining, ×100); B: Glycogen deposition (PAS staining×40)

2.2 實(shí)驗(yàn)鼠其他器官的病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

2.2.1脾臟病變:小鼠發(fā)現(xiàn)2例脾臟含鐵血黃素沉著(圖3B)，鏡下可見淋巴細(xì)胞分化完好，未見明顯異常，但局部區(qū)域可見大量吞噬了紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞即棕褐色的含鐵血黃素沉著。生理情況下在脾、肝、骨髓等組織內(nèi)可形成少量的含鐵血黃素，但當(dāng)含鐵血黃素局部沉積過多時(shí)，提示可能存在陳舊性出血。

圖3 脾臟HE染色(×40)注: A: 正常對(duì)照; B:含鐵血黃素沉著Fig.3 Pathological changes of spleen (HE×40)Note: A: Normal spleen; B: Hemosiderosis

2.2.2肺臟病變: 豚鼠肺臟檢出2例肺淤血，1例肺萎陷，病變率2.5%。與正常肺臟(圖4A)相比，肺淤血樣本可見整個(gè)肺臟有大量紅色物質(zhì)淤積，肺泡結(jié)構(gòu)不清，肺臟肺泡隔增寬；也可見細(xì)支氣管和較大的血管內(nèi)充滿紅細(xì)胞。部分區(qū)域可見少量粉染的蛋白樣滲出物(圖4B、C)。肺萎陷樣本可見肺臟肺泡塌陷，肺泡隔顯著增厚，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞淤積(圖4D)。小鼠、大鼠、地鼠肺臟均未見明顯異常。肺臟出現(xiàn)淤血、萎陷和間隔增寬可能與飼養(yǎng)環(huán)境中的墊料、空氣等因素及管理、處死方式有關(guān)。

圖4 肺臟HE染色(×10)注: A: 正常對(duì)照; B、C: 肺臟淤血；D：肺萎陷Fig.4 Pathological changes of lung (HE×10)Note: A: Normal lung; B、C: Pulmonary congestion; D：Pulmonary collapse

2.2.3小腸病變: 清潔級(jí)大鼠檢出1例小腸嗜酸性粒細(xì)胞增多。顯微鏡觀察,低倍鏡下可見小腸黏膜上皮有脫落，黏膜固有層有大量嗜酸性粒細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)(圖5A)。高倍鏡下可見嗜酸性粒細(xì)胞胞核呈分葉核、藍(lán)染，胞漿紅染(圖5B)。生理情況下在腸道存在少量的嗜酸性粒細(xì)胞，但當(dāng)其大量增多時(shí)提示腸道可能有炎癥。

3 討論

本次調(diào)查顯示肝臟病變主要出現(xiàn)于小鼠、大鼠和豚鼠，金黃地鼠肝臟未見明顯異常。小鼠肝細(xì)胞腫脹主要是由于糖原沉積造成，另有一例肝臟局灶性壞死；大鼠肝臟以脂肪變性為主，且均發(fā)生在清潔級(jí)大鼠；而豚鼠肝細(xì)胞脂肪變性和糖原沉積參半。肺臟病變主要發(fā)生于豚鼠，表現(xiàn)為肺臟淤血、滲出及肺萎陷。另有一例大鼠小腸嗜酸性粒細(xì)胞顯著增多。兩例小鼠脾臟含鐵血黃素沉著。全部實(shí)驗(yàn)鼠的腎臟、大腸等臟器在鏡下無明顯病理變化。綜上所述，絕大多數(shù)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康狀態(tài)，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)病變可能與飼養(yǎng)環(huán)境、飼料和飲水質(zhì)量以及采樣運(yùn)輸?shù)膽?yīng)激有關(guān)。

近七年來，本實(shí)驗(yàn)室共對(duì)3014例嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況進(jìn)行了病理學(xué)調(diào)查。其中包括不同數(shù)量不同級(jí)別的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠。本次調(diào)查結(jié)果顯示病變主要發(fā)生于肝臟和肺臟。HE染色顯示肝臟總病變率為6.7%，油紅O染色確診肝臟脂肪變性率為3.6%，PAS染色確診肝臟糖原沉積率為3.3%。肺臟病變主要發(fā)生于普通級(jí)的豚鼠中，總病變率為0.9%。另小腸和脾臟總病變率為0.3%和0.6%。

圖6 2011年5月至 2017年5月北京市嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病變檢出率注：A:肝臟病變率；B：肺臟病變率Fig.6 The detection rate of rodent laboratory animal pathological lesions in Beijing from 2011 to 2017Note: A: Rate of liver lesions; B: Rate of lung lesions

從歷年肝臟病變的統(tǒng)計(jì)分析來看(圖6A)，小鼠、大鼠和豚鼠的肝臟病變率均呈逐年下降的趨勢(shì)，豚鼠僅在2016年5月檢出肝臟病變，且病變率為5%。通常肝臟病變反映進(jìn)食情況，而數(shù)據(jù)顯示不論動(dòng)物級(jí)別如何，肝臟均有一定程度病變，說明肝臟損傷可能與飼料有關(guān)，而各受檢單位均使用目前市場(chǎng)上的成品飼料商品，可見其原料質(zhì)量及配方有待規(guī)范。而飲水來源則根據(jù)級(jí)別要求使用自來水或高壓滅菌自來水，故不排除自來水水質(zhì)如微生物含量，重金屬、消毒劑及農(nóng)藥殘留和硬度等對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的影響。秋冬季低溫同樣不容忽視，在低溫環(huán)境下動(dòng)物能量代謝加強(qiáng)， 需要通過增加采食量來維持熱平衡， 如果飼料供應(yīng)不足，同樣會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)不良和抗病力下降，飼喂過度又易造成脂肪沉積，動(dòng)物患肥胖病，故應(yīng)規(guī)范飼喂量和飼喂次數(shù)[2-9]。

從歷年肺臟病變的統(tǒng)計(jì)分析來看(圖6B)，小鼠、大鼠及豚鼠肺臟病變發(fā)生率均呈波動(dòng)趨勢(shì)，且每年秋季較為高發(fā)，2011年、2012年及2013年秋季肺臟病變檢出率均達(dá)到高峰。2014年以來，肺臟病變率呈下降趨勢(shì)。肺臟病變主要反映飼養(yǎng)環(huán)境空氣情況，歷年的調(diào)查結(jié)果顯示，普通級(jí)的實(shí)驗(yàn)鼠肺臟病變檢出率均較高?？梢娖胀?jí)動(dòng)物的空氣及墊料有待改善， 原因可能有墊料不合格及飼養(yǎng)密度過大等。劣質(zhì)的墊料碎屑及塵埃較多，極易造成異物刺激引發(fā)動(dòng)物肺部炎癥；飼養(yǎng)密度過大、溫濕度不適、通風(fēng)不良和飼養(yǎng)員清理不及時(shí)，室內(nèi)臭味和氨濃度升高容易誘發(fā)氣管炎、肺炎等。因而，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)過程中需要注意飼養(yǎng)環(huán)境的空氣情況、飼養(yǎng)密度以及通風(fēng)情況等，盡量減少室內(nèi)墊料碎屑、臭味和氨味等對(duì)動(dòng)物呼吸道的刺激[2-9]。

國(guó)際公認(rèn)的動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)是由世界動(dòng)物衛(wèi)生組織提出的動(dòng)物應(yīng)享受的五大自由：即享有不受饑渴的自由，享有生活舒適的自由，享有不受痛苦傷害和疾病威脅的自由，享有生活無恐懼和悲傷感的自由，享有表達(dá)天性的自由。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利要求在兼顧科學(xué)探索的基礎(chǔ)上最大限度地滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的五大自由[10]。 本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)七年的病理學(xué)調(diào)查都能觀察到嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同臟器出現(xiàn)不同程度的組織病理學(xué)損傷，主要有肝臟脂肪變性、肝臟局灶性壞死、間質(zhì)性肺炎、脾炎、心肌出血、腎臟蛋白樣滲出以及腸道寄生蟲等[3]，這些損傷證明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理水平良莠不齊，個(gè)別沒有達(dá)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利標(biāo)準(zhǔn)，部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于亞健康狀態(tài)。使用處于亞健康狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性會(huì)產(chǎn)生影響。雖然在每次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，被檢測(cè)動(dòng)物的微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)和遺傳學(xué)等指標(biāo)都能達(dá)到或符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但在病理學(xué)檢測(cè)中都能觀察到不同程度的組織病理學(xué)損傷。因而，通過病理學(xué)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況對(duì)于更好地保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利和保證科學(xué)研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性都具有重要的意義。