哺乳動物初乳中的乳鐵蛋白的抗菌機理研究

◎ 楊曉惠

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

初生哺乳動物的自身免疫防御系統(tǒng)不成熟，難以有效防御細菌。為使幼體補充必要的免疫物質(zhì)，對哺乳動物初乳中的乳鐵蛋白的攝入異常關鍵。乳鐵蛋白，簡稱LF（Lactoferrin），是分布于初乳中典型活性單體糖蛋白，可發(fā)揮抗病原微生物的作用，廣譜抗菌能力突出。包括人類在內(nèi)，哺乳動物初乳中的LF比后期常乳中含量多出十多倍。高濃度的蛋白表達下，LF的抗菌活性因其酶解后產(chǎn)生肽段而增強，它們的抗菌優(yōu)勢并非一般抗生素可比擬，對細菌類、病毒、真菌等有廣譜抗性，且無生物毒性，不存在外源性化學成分。由于LF酶解肽的抗菌模式不定，降低了受作用病原微生物的耐藥性[1]。

1 LF概述

1.1 LF物質(zhì)結構特性

LF，分子量近80 kDa，是一種鐵結合類單體糖蛋白，形成年限超1.25億年，與轉鐵蛋白系同源物質(zhì)，同屬轉鐵蛋白家族。其結構組成上，由對稱形式的N-葉和C-葉組成[2]。

對稱兩葉具有同源性，單葉可細分結構域。單體N-葉和C-葉均可獨立結合三價鐵離子，與鐵元素結合位置將出現(xiàn)4個氨基酸殘基。LF的表位電荷分布多為正電荷，因而遇到大量攜帶負電荷的細胞膜后可快速結合[3]。

LF常常會在無鐵（apo-LF）與鐵飽和（holo-LF）狀態(tài)中轉換，多數(shù)細胞的apo-LF將被排出細胞外，而若結合過量Fe3+則會變成holo-LF留在細胞內(nèi)。在人類的LF研究中，為消除水解酶作用并減少受體識別概率，LF可增加諸如磷酸化、N-聚糖等多元修飾位點。

1.2 LF物質(zhì)功能特性

LF蛋白在哺乳動物體內(nèi)的分布較為廣泛，多見于外分泌液（乳汁、唾液、淚液、鼻分泌物），且在血漿、羊水、膽汁、子宮分泌物、尿液以及中性粒細胞中也含量較多，相比較而言，屬初乳中含量最高。研究指出，LF可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡、參與骨髓細胞形成、激勵細胞生長、促進機體免疫、增強抗病性及抗高血壓性[2]。LF作為新型抗菌類生物藥物，可有效協(xié)同抗生素及抗真菌制劑作用于哺乳動物產(chǎn)生更多病理性作用。

1.3 LF物質(zhì)抗菌方式

①鐵剝奪是基本抑菌機制。主要是對哺乳動物體內(nèi)存在的apo-LF或不飽和LF而言，它們對鐵元素的結合性與掠奪性極強，主要在體內(nèi)參與細菌、真菌、病毒等病原性微生物的鐵元素競爭，大量結合鐵離子導致病原性微生物必要的鐵元素得不到補給從而死亡。當然，在LF大量結合鐵離子的過程中，部分微生物難以脫離鐵元素而生成致病性生物膜，整體上的降菌效果顯著。②膜滲透的基本作用機制原理在于通過電荷吸引來破壞細胞膜從而殺死病原菌，如對革蘭氏菌群而言，LF自帶正電荷，與革蘭氏陽性菌磷壁酸或革蘭氏陰性菌脂多糖之間形成電荷吸引，直接擊破細胞膜，破壞生理功能，提升通透性，同時使得脂多糖滲出，大量物質(zhì)流失導致病原菌被殺死。③酶抑制主要突出LF的酶體活性降解，從而有效減少各種細菌毒力因子或黏附蛋白，這樣可有效降低病原體與LF的有機結合，降低對哺乳動物細胞的不良侵入與影響。通常在LF表位攜帶有大量的正電荷，此電荷具有堿性、高密度特征，這樣就將直接與部分細菌或宿主細胞的生物分子結構相結合，因而產(chǎn)生更加明確的非特異性[3]。

2 LF與病原微生物細胞膜的結合能力

2.1 LF與細胞膜脂質(zhì)

在牙周炎的相關研究中發(fā)現(xiàn)，引發(fā)牙周炎的主要病菌為牙齦卟啉單胞菌和普雷沃菌，LF與酶解抗菌多肽都能抑制兩種病菌的生長，而LF將結合病菌細胞膜上的脂質(zhì)作用來完成抑制效果。

2.2 LF與細胞膜脂多糖

沙門氏菌與大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細胞外膜含大量脂多糖物質(zhì)，在與LF結合作用后，可解除細胞膜上的脂多糖。據(jù)研究，LF與脂多糖的結合得益于表位酶解肽段的作用，利用靜電作用等技術加強酶解多肽體與脂多糖的結合，可有效緩解脂多糖對哺乳動物機體刺激性。

2.3 LF與細胞膜蛋白

LF可利用細菌細胞膜表的結合蛋白促成與膜的結合。研究表明，若假單胞菌細胞表面的LF結合蛋白再次與LF集合，則可有效發(fā)揮阻礙生長的效果。對溶血性曼氏桿菌而言，LF發(fā)揮的抗菌殺菌作用機理在于其可結合菌體的外膜蛋白與孔蛋白。

3 LF的酶解多肽抗菌能力

3.1 Lfcin的抗菌機理研究

Lfcin是LF于胃部酸性環(huán)境的酶解作用下，由N端釋放的氨基酸殘基肽體，編號17-41段，自身無法結合鐵離子，囊括LF的所有生物學活性。Lfcin在LF結構中可于表面構建α-螺旋的二級結構，如圖1[4]所示。

圖1 Lfcin（17-41）與Lfampin（268-284）在LF中的位置分布圖

一旦在液相環(huán)境下，因水溶劑影響發(fā)生變構作用，將呈現(xiàn)兩個反相平行的β-折疊結構，如圖2[5]所示。特殊的α-螺旋二級結構增加了胞膜脂質(zhì)的親和力，可為LF的細胞膜結合提供必要的正向效果保障。

圖2 Lfcin抗菌肽的二級結構和表面電荷分布圖

Lfcin的抗菌殺菌作用機理，主要是依靠自身正電荷，與LF的膜滲透方式產(chǎn)生機制相類似，會與有關細胞壁酸質(zhì)或脂多糖發(fā)生靜電吸引作用，從而增加附著力，借助必要的疏水架構在細胞膜中完成脂質(zhì)分子層的變構，開辟傳輸路徑后確?？咕捏w可進入細胞中，或引發(fā)更多細胞膜的孔洞形成，使得細胞內(nèi)部物質(zhì)大量流失，從而實現(xiàn)滅菌效果。相關作用機理可利用熒光信號分子實驗來觀察分析流向，準確反饋不同細菌的細胞膜破裂滅亡情況。

3.2 Lfampin的抗菌機理研究

Lfampin來自于LF酶解肽段中的268-284部位氨基酸，可形成N端兩親性α- 螺旋結構，且C端的正電荷對抗菌作用的能力貢獻突出。

Lfampin與細菌胞膜的結合，主要是C端正電荷先行吸引細菌的蛋白外膜，然后由N端螺旋結構深度結合，顯然通過增加C端的正電荷物質(zhì)數(shù)可提升抗菌活性。在有效實驗中，采用人為干預的方式增加Lfampin的改造可增加抗菌肽的抗菌能力，如可串聯(lián)改造Lfampin與Lfcin肽段，合成物能夠發(fā)揮更強的細胞膜結合能力與抗菌活性。

3.3 LF的其他抗菌肽段抗菌機理研究

在人類LF的提取合成抗菌肽中，HLR1r能夠產(chǎn)生明顯的革蘭氏菌群抗性。對多肽LF11而言，自身對細胞膜的破壞功效是顯而易見。此外，利用清除非帶電荷殘基、補增肽體N端疏水氨基酸或增加N端酰化作用，都能夠增加多肽LF11的抗菌能力。而多肽L10對于耐藥性強的真菌殺傷效果顯著，主動結合細菌脂質(zhì)與脂多糖，增強胞膜的通透性，從而有效滅殺細菌。經(jīng)過研究，不少源自LF單倍的抗菌多肽都可發(fā)揮明顯的抑制真菌的作用。LF蛋白衍生多肽HLopt2和HLBD1可殺傷假絲酵母，特別是HLopt2能夠促使酵母菌細胞膜表出現(xiàn)大量凹陷或坑洞，增加對細胞膜的結構破壞力，發(fā)揮殺菌作用。

4 結語

通過對哺乳動物初乳中的乳鐵蛋白抗菌機理的諸多學術研究成果的梳理與總結可知，哺乳動物初乳所含LF能夠發(fā)揮出較為穩(wěn)定的抗菌生活活性，其活性往往受限于自身對細菌胞膜的結合能力，同時受LF酶解多肽段的抗菌能力的影響。因此，人們可視LF蛋白為重要的抗菌類物質(zhì)主體，是重要的展現(xiàn)膜結合能力的參與物質(zhì)，同時充當著降解酶的重要基礎物質(zhì)。綜上所述，LF的有效抗菌機理是先與細菌胞膜結合，使得LF發(fā)生一定的變構，提升對蛋白酶的敏感度， 且LF降解后可產(chǎn)生具有更高抗菌活性的多肽體，通過破壞細胞膜增加膜通透性來加快細胞內(nèi)物質(zhì)流失，從而達到殺菌的目的。