松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化保護(hù)作用研究

王淑敏，穆雙雙，王 方，曹 菁

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

各種原因引起的肝細(xì)胞變性壞死及炎癥，在壞死區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積，初期增生的纖維組織尚未形成假小葉，稱為肝纖維化(HF ) ，為可復(fù)性病變。當(dāng)肝損傷長(zhǎng)時(shí)間存在，肝臟中多種 ECM 異常聚集，進(jìn)一步纖維化，會(huì)逐漸發(fā)展為肝硬化，誘發(fā)肝功能衰竭和肝癌[1-2]。而肝星狀細(xì)胞（HSC）是 ECM 的主要形成細(xì)胞，HSC的活化被認(rèn)為是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。HSC的激活與多種細(xì)胞因子密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（ⅠL-6）等[3]。TGF-β一直被視為活化肝星狀細(xì)胞的主要細(xì)胞因子，TGF-β主要是通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮效應(yīng)?，F(xiàn)已證明許多中草藥和食藥用真菌具有肝保護(hù)作用和抗肝纖維化作用[3-5]。松杉靈芝（Ganodermats tsugae Murr.）為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌, 分布于黑龍江、吉林、甘肅等省,民間多當(dāng)靈芝入藥, 具有扶正固本, 滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效。具有增強(qiáng)脾臟NK細(xì)胞活性、促血漿ⅠFN因子生成及保肝、抗腫瘤和增強(qiáng)細(xì)胞免疫效應(yīng)的作用[6-7]。但松杉靈芝抗肝纖維化的作用在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道鮮見(jiàn)，本文重在探討松杉靈芝發(fā)酵菌絲抗CCl4引起的小鼠肝纖維化損傷作用及其作用機(jī)制。

1 材料

松杉靈芝發(fā)酵菌絲由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥用真菌研究室提供。SPF級(jí)C57小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌性，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。動(dòng)物批準(zhǔn)文號(hào)：SCXK（吉）2010-0009。CCl4、 橄 欖 油、ALT、AST、SOD、MDA、TNF-α、ⅠL-6均購(gòu)自南京建成生物有限公司；CCl4油液臨用前溶于橄欖油配成20%的濃度。麥角甾醇對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：MUST－11070601），甲醇為色譜純（美國(guó) Fisher 公司），為超純水（18.2ΩPa），其他試劑均為分析純。LC－20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；垂直電泳（國(guó)美伯樂(lè)）；生物顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 色譜條件 漢邦ODS－C 18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，流速 1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計(jì)不得少于 3 000。色譜圖見(jiàn)圖 1～2。

圖1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC 圖

圖2 松杉靈芝菌絲體 HPLC 圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取麥角甾醇對(duì)照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得（0.1 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取樣品（松杉靈芝菌絲體）0.5 g置干燥具塞的三角瓶中，加入10 mL甲醇，精密稱定重量，超聲提取 1 h，放至室溫，稱重，補(bǔ)加甲醇至原重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm濾膜，即得到供試品溶液備用。

2.3 肝纖維化模型建立及給藥 C57小鼠分為對(duì)照組肝纖維化模型組和松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療組，每組各10只，將小鼠腹腔注射20 % CCl4（2 mL/kg），用橄欖油（1:4）稀釋， 每周2次，持續(xù)6周，形成穩(wěn)定的肝纖維化動(dòng)物模型[8-9]。從造模第5周開(kāi)始采用松杉靈芝發(fā)酵菌絲0.5 g/kg和1 g/kg灌胃給藥14 d，對(duì)照組給予等體積的橄欖油，直至6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)停止給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠經(jīng)麻醉后，收集血清和肝臟標(biāo)本，一部分肝臟用10 %的福爾馬林固定，石蠟包埋，另一部分肝臟標(biāo)本采用液氮速凍并置于- 80 ℃保存待用。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 樣品中麥角甾醇含量測(cè)定 取松杉靈芝菌絲體粉末，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中麥角甾醇的含量，結(jié)果為3.29 mg/g。

2.4.2 血清學(xué)肝功能測(cè)定 取小鼠血液約0.3 mL，置干燥玻璃管內(nèi)，37 ℃保溫30 min，4 ℃冰箱靜置2 h，2 000 min，離心10 min，取血清，- 80 ℃保存自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)ALT和AST。

2.4.3 血清中 ⅠL-6、TNF-α 檢測(cè) 血清中 ⅠL-6、TNF-α檢測(cè)方法按照試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.4 肝臟組織SOD、MDA檢測(cè) 取小鼠肝組織，用生理鹽水1:9進(jìn)行勻漿，按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.5 HE染色 小鼠肝組織經(jīng)10%中性緩沖甲醛液固定、取材、乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片，作HE染色觀察肝纖維化程度。

2.4.6 Western blot 將肝組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜； 室溫封閉2 h，分別與TGF-β抗體、Smad-3抗體、p-Smad-3抗體、MMP3抗體、MMP9抗體一抗孵育，膜經(jīng)漂洗后再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件（UVP，UK）測(cè)定主帶的光密度值以計(jì)算TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)多組比較用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 松杉靈芝發(fā)酵菌絲減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟病理?yè)p傷 空白組肝臟肝細(xì)胞索排列較整齊，未見(jiàn)水樣變性及脂肪變性，未見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生及假小葉形成，枯否氏細(xì)胞未見(jiàn)增生, 毛細(xì)血管及匯管區(qū)內(nèi)膽管未見(jiàn)膽汁淤積，匯管區(qū)未見(jiàn)纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝臟均可見(jiàn)肝細(xì)胞水樣變性、肝細(xì)胞脂肪變性和壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，增生的纖維組織將肝組織分成廣泛的假小葉。松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療組能顯著改變上述病理改變。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)CCl4 誘導(dǎo)的小鼠肝臟病變的影響（HE，×100）

3.2 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)肝臟纖維化小鼠血液AST、ALT的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組血清AST和ALT顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療后血清AST和ALT顯著降低（P＜0.01，表1）。

3.3 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)肝臟纖維化小鼠肝臟SOD、MDA的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組的肝臟SOD顯著降低、MDA顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療后肝臟SOD顯著增高、MDA顯著降低（P＜0.01，表2）。

3.4 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)肝臟纖維化小鼠血清ⅠL-6、TNF-α 的影響 與空白組相比，肝纖維化模型組血清ⅠL-6和TNF-α顯著增高（P＜0.01）；給予松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療后血清ⅠL-6和TNF-α顯著降低（P＜0.01，表3）。

表1 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì) AST 和ALT 的影響（x± s ，n = 10）

表2 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì) SOD 和MDA 的影響（x± s，n = 10）

表3 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)ⅠL-6 和TNF-α 的影響（x± s ，n = 10）

3.5 松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9表達(dá)的影響 與空白組相比, 肝纖維化模型組的肝臟TGF-β、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平顯著升高（P＜0.01），Smad-3蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；給予松杉靈芝發(fā)酵菌絲治療后肝組織中TGF-β、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平降低（P＜0.01），Smad-3蛋白水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)圖4及表4。

表4 藥物對(duì)TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9的影響（x± s ，n = 3）

圖4 肝組織中TGF-β、Smad-3、p-Smad-3、MMP3、MMP9蛋白水平

4 討論

CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型其病理改變與人類肝纖維化的形態(tài)特征相似，本實(shí)驗(yàn)在皮下連續(xù)注射CCl4后，模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，部分肝細(xì)胞變性和壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，增生的纖維組織將肝組織分成廣泛的假小葉，提示模型復(fù)制成功。松杉靈芝發(fā)酵菌絲干預(yù)后，小鼠肝纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)，提示松杉靈芝發(fā)酵菌絲對(duì)小鼠肝纖維化具有一定的保護(hù)作用。

肝功能的改變可以反映肝臟的炎癥，肝細(xì)胞變性、壞死的程度。肝纖維化與肝細(xì)胞的損傷密切相關(guān)，肝細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜受損后，細(xì)胞膜通透性增高以及線粒體受到損傷，細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血清增多，通過(guò)測(cè)定血液中ALT和AST 可反映肝臟的受損情況[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給藥組能夠降低血清中ALT、AST 的含量，說(shuō)明松杉靈芝發(fā)酵菌絲能明顯改善小鼠肝臟受損的程度。

機(jī)體內(nèi)氧化自由基過(guò)剩，會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并形成脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物—MDA，MDA與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)合形成脂褐質(zhì)沉積于細(xì)胞中，造成細(xì)胞損傷。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是催化清除自由基的重要酶類，它可阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害。松杉靈芝發(fā)酵菌絲能顯著能提高肝纖維化小鼠血清中SOD水平，降低MDA水平，提示松杉靈芝發(fā)酵菌絲可通過(guò)催化SOD活性清除機(jī)體過(guò)量的氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而起到保護(hù)肝臟作用的。

ⅠL-6、TNF-α作為重要的促炎細(xì)胞因子，其大量合成與釋放會(huì)造成炎癥反應(yīng)。TNF-α能加強(qiáng)HSC的趨化性，促進(jìn)HSC增生，并可通過(guò)刺激肝臟炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生間接發(fā)揮促纖維化作用；ⅠL-6可刺激HSC增殖和?膠原合成，使HSC呈持續(xù)活化狀態(tài)，促進(jìn)肝纖維化的形成[11-13]。本研究中，給予松杉靈芝發(fā)酵菌絲干預(yù)后，可明顯抑制ⅠL-6、TNF-α的表達(dá)，對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)促炎因子，抑制星狀細(xì)胞（HSC）的活化，減少肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉淀有關(guān)。

肝纖維化的本質(zhì)是肝臟中ECM的過(guò)度沉積，TGF-β是促纖維化主要細(xì)胞因子之一，TGF-β可通過(guò)促進(jìn)HSC合成Ⅰ型、Ш型、ⅠV型膠原等增加ECM的合成。TGF-β是Ⅰ型膠原基因轉(zhuǎn)錄刺激因子，當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后激活Smad-3并磷酸化，與Smad-4形成異源三聚體復(fù)合物入核，與DNA結(jié)合，調(diào)控Ⅰ型膠原基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使肝組織纖維化[14-15]。實(shí)驗(yàn)證明，松杉靈芝發(fā)酵菌絲是通過(guò)下調(diào)TGF-β和抑制Smad-3磷酸化，阻斷TGF-β/ Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低Ⅰ型膠原基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；起到抗肝組織纖維化作用。

Seydel等在非酒精性脂肪肝體外實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)在人肝星狀細(xì)胞株XL-2細(xì)胞中維生素D2明顯抑制了游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的TGF-β和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，表現(xiàn)出維生素D2抗纖維化的作用[16]。松杉靈芝發(fā)酵菌絲中含有大量的麥角甾醇成分，麥角甾醇是一種重要的原維生素D，經(jīng)紫外光照射能轉(zhuǎn)化成為維生素D2。因此推測(cè)松杉靈芝發(fā)酵菌絲抗肝組織纖維化作用是所含麥角甾醇轉(zhuǎn)化成維生素D2，下調(diào)了TGF-β和α-SMA的表達(dá)而起到抗肝纖維化作用。

MMPs是一組降解ECM的最主要的酶系，參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，能特異性降解變性膠原、基底膜、Ⅰ型膠原及彈性蛋白，破壞基底膜、促進(jìn)炎癥過(guò)程中有關(guān)細(xì)胞的遷移以及ECM重建[17]。松杉靈芝發(fā)酵菌絲使肝組織MMP-3和MMP-9表達(dá)下調(diào)，可阻止肝纖維化和壞死細(xì)胞極度遷移增生，可有效控制肝組織的纖維化。

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，實(shí)驗(yàn)表明，松杉靈芝發(fā)酵菌絲可通過(guò)改善小鼠肝功能；清除機(jī)體過(guò)量的氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；下調(diào)促炎因子，抑制星狀細(xì)胞（HSC）的活化；通過(guò)TGF-β/ Smad-3信號(hào)轉(zhuǎn)到通路，下調(diào)TGF-β而抑制Smad-3磷酸化，降低?型膠原基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；通過(guò)所含的麥角甾醇轉(zhuǎn)化成維生素D2，下調(diào)TGF-β和α-SMA的表達(dá)；下調(diào)肝組織MMP-3和MMP-9表達(dá)，止肝纖維化和壞死細(xì)胞極度遷移增生等多方面共同作用而起到抗纖維化作用。提示人們可以利用工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)其發(fā)酵物，開(kāi)發(fā)具有預(yù)防和治療肝纖維化的保健食品或藥品。