氣腫疽梭菌多克隆抗體的制備及Dot-ELISA檢測方法的建立

張 皓， 姜永越， 陳 競， 于建華， 金 鑫*

(1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000； 2.圖們市農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)局,吉林 圖們 133100)

氣腫疽梭菌是主要引起反芻動物急性、熱性傳染病的病原體。該菌是專性厭氧菌，但極易形成芽孢，廣泛存在自然界中。世界很多國家均有該病的爆發(fā)[1]。我國很多地區(qū)也在流行著氣腫疽，對我國以及世界畜牧業(yè)的危害十分嚴重，而且氣腫疽的感染范圍在不斷擴大。感染動物不僅限于反芻動物，豬感染氣腫疽也時有發(fā)生，近年還有人感染氣腫疽的報道[2-4]?？梢?，氣腫疽的影響不僅僅是畜牧業(yè)，還嚴重危及著人類的健康[5]，因此，對氣腫疽的快速診斷與檢測研究具有重要意義。

目前對氣腫疽的檢測尚無標準方法，傳統(tǒng)的AGID試驗存在特異性低、靈敏度弱等缺陷。近年氣腫疽血清學檢測方法在ELISA檢測方法中已有突破，車達等[6]人采用氣腫疽梭菌菌體裂解抗原為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法，其特異性及靈敏度都達到很高水平，該方法有望在試劑盒的生產(chǎn)中得到普及應用，但其檢測結(jié)果還需在酶標儀等設備下進行，因此不適于基層現(xiàn)場的應用[7-9]。

本試驗探索了Dot-ELISA用于檢測氣腫疽梭菌病原的可行性，并就影響抗原抗體檢測的因素進行了討論和條件優(yōu)化，旨在為氣腫疽梭菌的臨床診斷提供更為簡便、快速、特異、敏感的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

氣腫疽梭菌標準株C54-1,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；試驗動物SPF豚鼠，購自長春億斯試驗動物中心；標準陽性血清和陰性血清采自試驗豚鼠；全菌抗原和分泌抗原從致病豚鼠臟器分離培養(yǎng)后提取,由延邊大學農(nóng)學院預防獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 主要試劑

標準蛋白Marker(購自華美科技有限公司)；HRP羊抗豚鼠IgG和BSA，購自美國西格瑪公司；DAB(購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(購自拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；濾菌膜(0.22、0.45 μm)(購自美國PALL公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 陽性血清的制備

將培養(yǎng)的氣腫疽梭菌培養(yǎng)液離心獲得菌體菌液，在冰水浴下超聲波破碎裂解出菌體抗原；將粗提的菌體抗原經(jīng)SephadexG-200過濾，以每管1 mL收集抗原蛋白。將純化的菌體抗原接種10只豚鼠，第1次0.1 mg，第2次0.2 mg，第3次0.3 mg，每次間隔7 d。最后1次接種5 d后心臟采血分離血清。

1.4 Dot-ELISA操作程序

將抗體用0.01 M pH值為7.4的PBS(含1%BSA)稀釋100倍，用微量進樣器吸取1 μL高免血清點到經(jīng)過壓跡后的pvdf膜片正面方格正中央，置于37 ℃恒溫箱干燥或者自然晾干。將干好的膜片取出放進封閉液中浸泡30 min，保存于4 ℃冰箱中備用。膜片剪成4 mm2的方格，正面朝上加入孔中。每孔加入50 μL,用0.01 mol/L pH值為7.4的PBS稀釋成1∶80倍的抗原，每塊反應孔均設置陰性對照，整體設置空白孔作對照和陽性對照，放入37 ℃恒溫箱作用30 min。每孔加入50 μL含0.1% BSA的0.01 mol/L pH值為7.4的PBS稀釋成1∶2 000倍的酶標二抗，放于37 ℃反應30 min。每孔加入50 μL現(xiàn)配的DAB溶液,置于37 ℃恒溫箱中作用15 min。加入蒸溜水終止反應，晾干。

結(jié)果以下述標準判定：強陽性呈深棕色斑點，斑點與周圍接線清晰、明了；弱陽性呈淺棕色斑點，斑點周圍界限清晰或斑點內(nèi)有不均質(zhì)淺棕色斑點；陰性沒有斑點。每次試驗均設立陽性、陰性血清對照，空白膜片對照，血清空白對照和酶空白對照，對照成立才能做出判定。

1.5 最佳工作條件的篩選

1) 血清最適稀釋倍數(shù)的確定 將血清由1∶2倍比稀釋至1∶10 240，分別與相同濃度的抗原作用，保持酶標二抗?jié)舛燃胺跤龡l件一致，根據(jù)判定標準篩選出最適血清稀釋倍數(shù)。

2) 抗原最適濃度的確定 抗原調(diào)節(jié)濃度為1 mg/mL,將提取的被檢抗原由1∶2倍比稀釋至1∶40 960，菌體抗原于PVDF膜上點樣，分泌抗原于NC膜上點樣，采用 Dot-ELISA 方法進行試驗，依據(jù)判定標準篩選最佳抗原濃度，作為試驗抗原最適工作濃度。

3) 酶標二抗最適稀釋倍數(shù)的確定 將HRP標記羊抗豚鼠IgG從1∶125倍比稀釋至1∶64 000，其他條件不變，篩選最佳二抗?jié)舛取?/p>

4) 封閉液及封閉時間最適的確定 5%脫脂乳、1%BSA、3%豚鼠血清、3%兔血清，以0.01 mol/L pH值為7.4的PBS為空白對照，封閉時間分設置為20、30、40、50、60 min，進行間接 Dot-ELISA。

5) 底物最適反應時間的確定 其他條件最適情況下，DAB顯色液分別顯色5、10、15、20、25、30、35、40 min，進行試驗。

6) 最適反應溫度及時間的確定 控制抗原抗體濃度最適的條件，將反應分別放置于4 ℃、室溫和37 ℃恒溫條件下作用，同一溫度下分別作用20、30、40、50 min，觀察顯色斑點顏色。

1.6 Dot-ELISA敏感性試驗

將純化的抗原用0.01 mol/L pH值為7.4的PBS以10倍比連續(xù)稀釋，按已經(jīng)建立的雙抗體夾心Dot-ELISA方法進行檢測，重復3次，并設置陰性和空白對照。

1.7 Dot-ELISA特異性的檢測

1) 交叉反應試驗 以最適濃度的抗血清包被的PVDF膜，分別與腐敗梭菌抗原、產(chǎn)期莢膜梭菌B、C、D、E型抗原及氣腫疽梭菌抗原，建立的雙抗體夾心法Dot-ELISA進行多次重復檢測。

2) 阻斷試驗 將抗原做1∶10～1∶10 240 倍稀釋，同一稀釋度分成2組，一組加等量診斷血清，另一組抗原加等量血清稀釋液作為對照，并用雙抗體夾心 Dot-ELISA 方法檢測，最后以加血清的阻斷組不顯示斑點，不加抗原的未阻斷組顯現(xiàn)明顯斑點，判定為特異性反應。

1.8 比較試驗

以分離延邊氣腫疽梭菌強毒株菌體直接肌肉注射20只豚鼠，建立氣腫疽梭菌感染模型，對死亡豚鼠剖檢，無菌采集其肝、脾、心、肺、腎、肌肉，制成菌懸液，用AGID法和建立的雙抗體夾心Dot-ELISA方法同時檢測以上豚鼠抗原樣本，對比陽性檢出率。

1.9 臨床樣本的檢測

利用所建立的雙抗體夾心Dot-ELISA方法和云巾宴所建立的PCR方法[10],對50份病料進行檢測。取病料組織小塊分別在無菌條件下研磨，制成菌懸液，同時應用2種方法檢測，并對比檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Dot-ELISA 試驗條件的篩選

2.1.1 血清最適稀釋倍數(shù)的確定

制備的血清與被檢抗原反應的最佳工作范圍是 1∶2～1∶2 048，當抗體濃度在以上范圍時，可表現(xiàn)明顯斑點現(xiàn)象，由于 1∶2 048處于臨界狀態(tài)，強陽性與弱陽性差異不明顯，所以選擇 1∶1 024 稀釋度為最佳稀釋倍數(shù)操作(圖1)。

圖1 不同血清稀釋倍數(shù)的反應結(jié)果

2.1.2 被檢抗原最適濃度的確定

菌體抗原在1∶512 ，含量為3.125 μg時出現(xiàn)邊緣整齊，著色明顯與1∶1 024 倍稀釋時顏色明顯有差異性，分泌抗原在1∶256滴度，含量1.89 μg時差異明顯，所以菌體抗原和分泌抗原最適稀釋倍數(shù)分別選定為1∶512，和1∶256(圖2)。

圖2 不同被檢抗原稀釋倍數(shù)的反應結(jié)果

2.1.3 酶標二抗最適稀釋倍數(shù)的確定

將HRP標記的羊抗豚鼠IgG由1∶125倍比稀釋至1∶64 000 。以最佳血清包被濃度和最佳抗原稀釋度進行Dot-ELISA檢測，當酶標二抗稀釋由1∶125倍比稀釋至1∶4 000時,反應膜片的顏色明顯，故本試驗選取1∶4 000作為最適酶標二抗稀釋濃度(圖3)。

圖3 酶標二抗最適稀釋度確定

2.1.4 最適封閉液及封閉時間的確定

結(jié)果顯示37 ℃ 1%BSA封閉30 min效果最好，背景色差異最大，斑點清晰。

2.1.5 最適反應時間及溫度的確定

在抗原及抗體濃度最適的條件下，室溫條件和37 ℃條件下診斷膜片上的斑點印跡明顯，反應作用 30 min以上時診斷膜上斑點的顏色便不隨時間的增加而加深，為試驗的精確性起見，以37 ℃為試驗的標準溫度，以30 min作為最適反應時間。

2.2 敏感性測定

在各反應條件確定的前提下，重復3次試驗，結(jié)果均一致，菌體抗原效價3.125 μg/mL，分泌抗原1.89 μg/mL，陰性對照組無斑點顯現(xiàn)。該結(jié)果表明,建立的雙抗體夾心Dot-ELISA方法具有良好的敏感性(圖4)。

圖4 敏感性測定

2.3 特異性試驗

2.3.1 交叉反應試驗

在最佳條件下，重復3次試驗，只有氣腫疽梭菌陽性血清的膜片出現(xiàn)反應，說明所建立的Dot-ELISA方法有較高的特異性(圖5)。

2.3.2 阻斷試驗

阻斷前的強陽性血清、弱陽性血清終點效價分別為1∶5 120和1∶320,而阻斷后其各自的終點效價分別為1∶80和1∶20,說明被阻斷的是特異性抗體。

圖5 Dot-ELISA交叉反應試驗結(jié)果

2.4 比較試驗

應用Dot-ELISA方法檢測20只氣腫疽病死豚鼠各臟器病原體的陽性率，其中肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉陽性率分別為95%、95%、90%、 90%、85%和90%，AGID法檢測肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉陽性率分別為29%、31%、25%、 36%、20%和25%(表1)。

表1 Dot-ELISA方法與AGID試驗方法比較

2.5 臨床樣本的檢測

利用所建立的雙抗體夾心Dot-ELISA方法和PCR方法對50份病料進行檢測的結(jié)果顯示，Dot-ELISA檢測出7份陽性樣品(檢出率為14%)，PCR方法檢測出9份陽性樣品(檢出率為18%)(表2)。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

Dot-ELISA檢測血清中的抗體時，對采集樣本及樣本保存運輸過程要求高，一旦保存環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，會對結(jié)果判定造成影響。該試驗采用了包被抗體檢測抗原的方式，方便了樣本的收集，只需無菌采集樣本即可，使用包被好的快診膜最快2 h便可以觀察到結(jié)果，使檢測更為方便。雙抗體夾心Dot-ELISA檢測抗原特異性特別強[11-13],該試驗采用了SPF豚鼠，并以純化的菌體抗原免疫動物，獲得的血清得到很好的使用效果。今后對于該技術(shù)的研究還可用通過制備單克隆抗體提高檢測的特異性和準確性[14-17]。

影響Dot-ELISA結(jié)果的因素很多，從樣品的采集、保存、加樣到洗滌和顯色過程中都可產(chǎn)生試驗誤差，因此，對于Dot-ELISA的操作環(huán)節(jié)要嚴格標準，才能提高試驗質(zhì)量[18]。利用96孔板分裝載體膜的顯色工作要遠比ELISA方法復雜，尤其對于幾十到上百的樣品檢測過程中，加入試劑及混勻的時間存在很大差異，使得酶促反應的時間不一致造成試驗假陽性或假陰性的結(jié)果。對此，可以將樣品分批操作，保證同一批樣品幾乎在同一時間內(nèi)完成反應，既減少單次試驗的時間，也避免了批次內(nèi)操作的誤差[19-20]。

本方法經(jīng)特異性試驗、敏感性試驗及比較試驗和臨床樣本檢測，該檢測方法敏感、特異，可應用于臨床快速檢測。