生物反應(yīng)器中金線蓮叢生芽的增殖及酚和黃酮積累的研究

田 文, 金美玉, 于 垚, 李金蓉, 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉 133002)

金線蓮是一種十分珍稀的中草藥，可全草入藥，其味甘，性微寒，具有清熱解毒的功效[1]。金線蓮目前在臨床上的應(yīng)用比較廣泛，如治療肺炎、肝炎、糖尿病、高血壓和風(fēng)濕病等[2]。其植株含有黃酮、酚、多糖、生物堿等多種成分[3]，其中,黃酮類化合物具有抗菌、消炎、護肝、利尿、抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶、預(yù)防心血管疾病等效果[4-8]。酚類物質(zhì)是體內(nèi)具有較強生理學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性活性物質(zhì)[7]，具有抗氧化、抗誘變、抗衰老和抗病毒等作用[8-10]，具有廣闊的開發(fā)利用前景。但是，野生金線蓮對自然環(huán)境的要求十分嚴格，且因毀滅性的開采，資源遭到嚴重破壞；而傳統(tǒng)的人工栽培植物生長緩慢，有效物質(zhì)含量較低，很難滿足市場需求。因此，亟待探尋一種有效生產(chǎn)金線蓮植物材料的方法。

植物組織培養(yǎng)手段是取代傳統(tǒng)的植物材料繁殖的主要途徑[11]，這種方式結(jié)合生物反應(yīng)器可實現(xiàn)通過大量培養(yǎng)植物材料，高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)有效物質(zhì)的目的[12]。目前，金線蓮組培有許多研究報道，主要通過研究激素、外植體、光照和培養(yǎng)方式對金線蓮試管苗的影響，獲得優(yōu)質(zhì)金線蓮種苗[13-14]。但通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)金線蓮有效物質(zhì)的研究較少。生物反應(yīng)器植物器官培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)方式對培養(yǎng)物生物量的影響很大[15]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，金線蓮叢生芽在無 “載橋”反應(yīng)器內(nèi)進行懸浮培養(yǎng)時，隨著生物量的增加，叢生芽沉積于生物反應(yīng)器底部的氣體分布器上，這些叢生芽在培養(yǎng)中后期變褐，甚至死亡。另外，培養(yǎng)時期的選擇是有效進行生物反應(yīng)器培養(yǎng)的重要條件。通過對培養(yǎng)物生長和物質(zhì)合成動態(tài)研究，可確定適宜的培養(yǎng)周期[16]。此外，在植物細胞培養(yǎng)中，許多研究都采用生物和非生物刺激的方法進行培養(yǎng)，這種方法是促進有效物質(zhì)積累的重要措施[17]，因此，本文在起升式生物反應(yīng)器中不同位置架設(shè)“載橋”后進行叢生芽培養(yǎng)，確定最佳的反應(yīng)器培養(yǎng)方式；同時通過動態(tài)研究篩選適宜金線蓮叢生芽培養(yǎng)的適宜時期。為提高金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮的含量，采用水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及酵母提取物(YE)等作為誘導(dǎo)子，研究了誘導(dǎo)子種類、處理時間與處理濃度的影響，篩選最佳的誘導(dǎo)子及其使用方法。

1 材料與方法

1.1 材料

將金線蓮 (Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.) 試管叢生芽接種于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基[13]為3/4MS基本培養(yǎng)基附加 6-芐氨基嘌呤(6-BA)2.0 mg/L + 激動素(KT)0.2 mg/L+ 萘乙酸(NAA)0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為5.8。在溫度(25±2) ℃，光照強度為1 600 lx，每天光照16 h條件下進行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后，將叢生芽切成單體作為該試驗的材料。

1.2 方法

1.2.1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對叢生芽增殖及總酚與總黃酮含量的影響

利用3 L氣球型氣升式生物反應(yīng)器，設(shè)置3種培養(yǎng)方式(UN、NB和NM)進行叢生芽培養(yǎng)(圖1)。

1) UN：生物反應(yīng)器內(nèi)無“載橋”；2) NB：在生物反應(yīng)器球體底部架“載橋”；3) NM：在離生物反應(yīng)器球體底部5 cm處架“載橋”。每個生物反應(yīng)器中加入2 L叢生芽增殖培養(yǎng)基(3/4 MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖35 g/L)，培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為5.8。每個反應(yīng)器接種20 g(鮮重)的叢生芽外植體，通入氣體400 mL/min。在溫度(25 ±2) ℃，光照強度為1 600 lx，每天光照16 h條件下進行培養(yǎng)(下同)。培養(yǎng)30 d后調(diào)查叢生芽生物量(鮮重和干重)，并計算增殖系數(shù)，同時測定叢生芽中總酚和總黃酮含量，并計算其生產(chǎn)量。增殖系數(shù)和酚及黃酮的生產(chǎn)量按以下公式進行計算。

增殖系數(shù)=(收獲后叢生芽鮮重-接種叢生芽鮮重)/接種叢生芽鮮重

酚(黃酮)生產(chǎn)量/(mg/L)= 酚(黃酮)含量/(mg/g)×收獲后叢生芽干重/(g/L)

圖1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式

1.2.2 生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)動態(tài)

采用NB培養(yǎng)方式進行研究。將20 g(鮮重)叢生芽外植體接種于含2 L增殖培養(yǎng)基的反應(yīng)器中。從接種第1天開始，每隔5 d收獲叢生芽樣品，直至40 d。通過測定不同培養(yǎng)時期叢生芽總酚和總黃酮的含量及分析其生產(chǎn)量，探明其動態(tài)變化，確定最佳的培養(yǎng)周期。

1.2.3 誘導(dǎo)子對叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

取3 g(鮮重)叢生芽外植體接種于含100 mL叢生芽增殖培養(yǎng)基(液體)的250 mL錐形瓶中，進行振蕩培養(yǎng)(振幅為120 rpm)，培養(yǎng)30 d后分別用SA、MeJA和YE進行處理。為了篩選最適處理時間，用500 μM的SA和MeJA分別處理0、4、8、10、12、14、16、20 d，用100 μM的YE處理0、2、4、5、6、8、10 d。之后進行誘導(dǎo)子濃度的篩選，SA和MeJA處理濃度設(shè)置為0、400、450、475、500、525、550、600 μM，處理時間SA為12 d，MeJA為16 d；YE濃度設(shè)置為0、25、50、75、100、125、150 μM，處理時間為4 d。

最后比較3種誘導(dǎo)子對生物反應(yīng)器內(nèi)叢生芽中酚及黃酮積累的影響。利用3 L反應(yīng)器，采用NB法培養(yǎng)叢生芽，30 d后，分別加入500 μM的SA處理12 d，525 μM的MeJA處理16 d和75 mg/L的YE處理4 d，以未加誘導(dǎo)子為對照(CT)。叢生芽收獲后，測定總酚和總黃酮含量。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定

收獲的叢生芽用自來水清洗2～3次，除去表面水分并瀝干后稱鮮重。之后，叢生芽放入干燥箱中，45 ℃下干燥48 h，稱干重。

1.3.2 總酚含量的測定

總酚含量的測定參照Folin等[18]方法。稱取叢生芽的干燥粉末100 mg，加入80%甲醇15 mL，80 ℃煮2 h，冷卻后4 ℃離心15 min(500 r/min)。取上清液定容至25 mL，利用紫外分光光度計，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，在760 nm波長下測定吸光值。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定參照吳榮志等[19]方法，稱取叢生芽的干燥粉末100 mg，加入70%乙醇15 mL，60 ℃煮2 h，冷卻后4 ℃離心15 min(500 r/min)。取上清液定容至25 mL，利用紫外分光光度計，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，在510 nm波長下測定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Excel 2010和SPSS 22軟件進行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法(P<0.05)進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對金線蓮叢生芽增殖及總酚與總黃酮含量的研究

培養(yǎng)方式對金線蓮叢生芽增殖和總酚與總黃酮含量有顯著影響。在有“載橋”反應(yīng)器(NB和NM)中進行叢生芽培養(yǎng)，30 d后發(fā)現(xiàn)叢生芽增殖生長明顯好于無“載橋”反應(yīng)器(UN)培養(yǎng)(圖2)。在NB培養(yǎng)方式中，叢生芽鮮重和干重分別達到142.19和18.71 g，顯著高于NM和UN，且增殖系數(shù)也最高，為13.22(表1)。

UN：無“載橋”培養(yǎng)；NB和NM：有“載橋”培養(yǎng)

培養(yǎng)方式生物量/g鮮重干重增殖系數(shù)UN87.10±0.49 c13.78±0.60 c7.71±0.05 cNB142.19±2.13 a18.71±0.32 a13.22±0.21 aNM132.33±2.73 b16.81±0.36 b12.23±0.27 b

注：UN：無“載橋”培養(yǎng)；NB和NM：有“載橋”培養(yǎng)。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。不同字母表示0.05水平上差異顯著，下同。

培養(yǎng)方式對叢生芽中酚與黃酮積累影響也很大(圖3)。NB與NM培養(yǎng)中，總酚與總黃酮含量無顯著性差異，2種培養(yǎng)方式中總黃酮含量顯著高于UN；但總酚含量在NB，NM低于UN。對總酚和黃酮生產(chǎn)量進行分析結(jié)果，NB中總酚生產(chǎn)量(46.12 mg/L)與總黃酮生產(chǎn)量(41.44 mg/L)最高，其次為NM(總酚42.12 mg/L,總黃酮37.23 mg/L)，UN最低(總酚37.90 mg/L，總黃酮27.42 mg/L)。因此，NB培養(yǎng)方式也有利于酚和黃酮積累，是生物反應(yīng)器內(nèi)進行金線蓮叢生芽培養(yǎng)的一種適宜培養(yǎng)方式。

圖3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式對金線蓮叢生芽總酚與總黃酮積累的影響

2.2 生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)動態(tài)研究

由圖4可知，在金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，叢生芽中酚與黃酮積累發(fā)生動態(tài)變化。在培養(yǎng)30 d內(nèi)，叢生芽中總酚和總黃酮含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而提高，培養(yǎng)第30天時最大，此時總酚

含量達到6.7 mg/g,總黃酮含量達到4.4 mg/g。但培養(yǎng)天數(shù)超過30天后，總酚和總黃酮含量呈下降趨勢。對總酚和黃酮生產(chǎn)量(叢生芽干重物質(zhì)含量)進行分析的結(jié)果與物質(zhì)含量的變化趨勢一致，在培養(yǎng)第30天時，2種物質(zhì)的生產(chǎn)量均達到最大，總酚和總黃酮生產(chǎn)量分別為58.8 mg/L和39.2 mg/L。因此，可以確定金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)時，30 d為適宜的培養(yǎng)周期。

圖4 金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中酚與黃酮積累的變化

2.3 誘導(dǎo)子對叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

誘導(dǎo)子處理時間對金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量有顯著的影響(圖5)。對于SA，10 d時總酚和總黃酮含量最高，分別為8.5 mg/g和4.4 mg/g；對于MeJA，處理16 d時總酚和總黃酮的含量最高，分別為8.57 mg/g和4.24 mg/g；而對于YE，處理4 d時總酚與總黃酮含量最高，分別為7.43 mg/g和5.13 mg/g。

誘導(dǎo)子濃度的影響如圖6所示，SA濃度為500 μM，MeJA濃度為525 μM，而YE濃度為75 mg/L時，叢生芽中總酚和總黃酮含量最高。

圖5 誘導(dǎo)子處理天數(shù)對金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

圖6 誘導(dǎo)子處理濃度對金線蓮叢生芽中總酚與總黃酮含量的影響

3種誘導(dǎo)子最佳處理時期和處理濃度確定后，在生物反應(yīng)器叢生芽培養(yǎng)至30 d時，分別用3種誘導(dǎo)子進行處理，通過總酚和總黃酮含量的測定，比較了3種誘導(dǎo)子的處理效果。由圖7可見，3種誘導(dǎo)子對叢生芽中總酚和總黃酮含量均具有促進效果，SA、MeJA和YE處理均顯著高于未處理的叢生芽(CT)，但誘導(dǎo)子處理間總酚含量無顯著性差異。對于黃酮，MeJA處理中黃酮含量(6.13 mg/g)顯著高于其他處理，依次是SA(4.95 mg/g)和YE(4.71 mg/g)處理。3種誘導(dǎo)子處理的黃酮含量均顯著地高于CT。因此，在金線蓮叢生芽生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，為了提高酚和黃酮的積累，可在叢生芽培養(yǎng)30 d時加入525 μM的MeJA處理16 d。

圖7 誘導(dǎo)子對總酚與總黃酮含量影響的比較

3 討論與結(jié)論

利用氣升式反應(yīng)器進行金線蓮叢生芽的培養(yǎng)過程中，由于叢生芽生物量的增加，通氣動力難以使叢生芽上浮，導(dǎo)致叢生芽下沉至反應(yīng)器底部，在空氣分布器上堆積，這一方面抑制氣體通入，使培養(yǎng)物無法隨培養(yǎng)液進行流動，另一方面又使沉積于底物的叢生芽受到氣體脅迫而影響其進一步的生長[20]。反應(yīng)器內(nèi)架設(shè)支持網(wǎng)(載橋)，有利于植物器官生物反應(yīng)器培養(yǎng)，韓璐等[21]在進行白鶴芋組培苗培養(yǎng)時，通過架設(shè)“載橋”得到的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的組培苗，這與本文在反應(yīng)器中架設(shè)“載橋”培養(yǎng)的結(jié)果一致。但是，同樣是反應(yīng)器“載橋”培養(yǎng)，NB的生物量與有效物質(zhì)積累好于NM，這可能是因不同位置的“載橋”對通入氣體有不同程度的阻遏，導(dǎo)致NB和NM中實際含氣量不同，從而使叢生芽生物量和物質(zhì)積累出現(xiàn)差異。在利用生物反應(yīng)器進行植物組織培養(yǎng)的過程中，通過對不同培養(yǎng)時期培養(yǎng)物中有效物質(zhì)的測定，可以確定最佳的培養(yǎng)周期。張萬博等[22]為了探明生物反應(yīng)器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織中黃酮類物質(zhì)積累的最佳時期，對培養(yǎng)5～30 d內(nèi)愈傷組織中黃酮積累的動態(tài)變化進行了分析，最終確定25 d為狼爪瓦松愈傷組織培養(yǎng)的最佳時間。然而，該研究在進行金線蓮生物反應(yīng)器研究時，培養(yǎng)30 d時可獲得最多的酚和黃酮，因此，30 d為最佳的培養(yǎng)周期。這種結(jié)果表明，在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)不同植物、不同外植體時的最佳培養(yǎng)周期不同，應(yīng)針對不同植物選擇適宜的培養(yǎng)周期。

SA參與植物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)控次生代謝途徑關(guān)鍵酶的活性來影響次生代謝產(chǎn)物的合成，或通過增加苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶的活性，促進相關(guān)代謝產(chǎn)物的積累[23]。研究表明，一定濃度SA能有效地提升茜草細胞中有效物質(zhì)的含量[24]，這與本文研究結(jié)果一致。MeJA可誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種抗逆基因的表達，促進各種酶的合成，提高培養(yǎng)物總酚與總黃酮的生產(chǎn)，從而為獲得目標(biāo)次生代謝物提供了有效手段[25]。外源施加MeJA對葡萄懸浮培養(yǎng)細胞中總酚含量有明顯促進作用[26]，這中結(jié)果本研究中MeJA對金線蓮叢生芽總酚和總黃酮含量的作用效果相似。YE可活化次生代謝物生物合成相關(guān)酶，提高次生代謝物的積累量。郭雙等[27]研究結(jié)果表明，YE可以提高顛茄毛狀根有效物質(zhì)的積累量。本試驗中YE也可提高金線蓮叢生芽總酚與總黃酮的含量，這為YE可作為金線蓮組織培養(yǎng)生產(chǎn)總酚與總黃酮的誘導(dǎo)子提供了理論依據(jù)。通過比較SA、MeJA和YE，MeJA對酚和黃酮積累效果最佳，因此，建議在生物反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮叢生芽時，可用MeJA作為誘導(dǎo)子來使用。