四環(huán)素類藥物對(duì)鯉細(xì)胞色素P450酶系生化指標(biāo)的影響

李在建，劉文強(qiáng)，司振書，朱明霞

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000)

四環(huán)素類藥物是在魚類上應(yīng)用比較早的抗菌藥物，具有療效確定、抗菌譜廣、方便安全的特點(diǎn)。它們對(duì)革蘭氏菌、立克次體、螺旋體、支原體等均可產(chǎn)生抑制作用。對(duì)淡水魚養(yǎng)殖中的魚類赤鰭病、弧菌病、爛尾病及鯉科魚類痘瘡病具有較好的效果，在淡水魚養(yǎng)殖過程中被大量使用。該類藥物在魚病防治上通常采用口服給藥方式，用來治療魚類的全身感染或腸道疾病[1]。細(xì)胞色素P450是含有血紅素的一組蛋白質(zhì)，是一個(gè)由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因超家族編碼的同工酶所組成的超家族酶系，該酶系主要分布在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上[2]。其主要生理功能是參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)外環(huán)境與機(jī)體的相互作用以及保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起到至關(guān)重要的作用[3-5]。四環(huán)素類藥物對(duì)肝藥酶的影響在魚類上研究較少，為此研究了4種四環(huán)素類藥物對(duì)鯉肝細(xì)胞色素P450(CYP450)酶系生化指標(biāo)的影響，旨在為進(jìn)一步研究四環(huán)素類藥物對(duì)探針?biāo)幬镌诟挝⒘ｓw中代謝的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采用體質(zhì)量為(350±30)g的健康鯉72尾，飼喂不含有抗菌藥物的鯉全價(jià)飼料并采用循環(huán)水養(yǎng)殖，適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d，水的pH值保持在7.0。溫控系統(tǒng)控制水池溫度在(15±1)℃。

1.2 主要試劑

牛血清蛋白，購(gòu)于Roche公司；NADPH，購(gòu)于Roche公司；考馬斯亮藍(lán)G250，進(jìn)口分裝；細(xì)胞色素C，購(gòu)于Sigma公司；一氧化碳，購(gòu)于常州市京華工業(yè)氣體有限公司；氨基比林、紅霉素、二甲基亞砜，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑，分析純AR。

1.3 主要儀器和設(shè)備

低溫高速離心機(jī)、低溫超速離心機(jī)，Beckman公司生產(chǎn)；紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn)；電子天平(JY2002)，上海市精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；分析天平(BP211D)，德國(guó)Sartoraus公司生產(chǎn)；漩渦混懸器，上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)；HHS型不銹鋼電熱恒溫水浴鍋，武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；YKH性液體快速混合器，江西醫(yī)療機(jī)械廠生產(chǎn)。

1.4 給藥處理

將試驗(yàn)鯉魚隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(二甲基亞砜)、土霉素(OTC)處理組、四環(huán)素(TC)處理組、金霉素(CTC)處理組和多西環(huán)素(DOTC)處理組。OTC、TC、CTC處理組按20 mg/kg·bw，DOTC處理組按5 mg/kg·bw，將藥物溶于二甲基亞砜，灌入鯉魚的前腸，對(duì)照組不做任何處理，溶劑對(duì)照組灌入等劑量的二甲基亞砜，每天一次無回吐者保留試驗(yàn)，連續(xù)處理5 d，第5天將魚處死，制備魚的肝微粒體，測(cè)定鯉的肝微粒體蛋白含量、氨基比林-N-脫甲基酶、肝臟細(xì)胞色素P450含量以及酶系的活性。

1.5 肝微粒體的制備

肝微粒體的制備參照文獻(xiàn)[6-7]，取出鯉肝臟，用生理鹽水沖去血漬、濾紙擦干、稱量。根據(jù)肝質(zhì)量和體質(zhì)量計(jì)算相對(duì)肝質(zhì)量。微粒體采用差速離心法制備，即靠近肝門靜脈處取肝臟4 g，放入小燒杯中，剪碎后按1∶3的比例加入勻漿緩沖液，用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿。勻漿液4 ℃、11 000×g高速離心20 min，上清液4 ℃、105 000×g超速離心60 min，紅色沉淀即為肝細(xì)胞微粒體組分。將微粒體沉淀取出后用含250 mL/L甘油的KCl-磷酸鹽緩沖液懸浮，每克肝加懸浮液1 mL渦旋混勻后分裝于凍存管中，-80 ℃存放。

1.6 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.6.1 肝微粒體蛋白含量 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參照文獻(xiàn)[8]，取8支試管，標(biāo)號(hào)，依次在試管中加入2 mg/mL BSA溶液0、10、20、30、40、50、60、70 μL，各管用超純水補(bǔ)足至0.1 mL，得到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL系列質(zhì)量濃度的BSA溶液0.1 mL；然后加入5 mL Bradford應(yīng)用液，立即混勻，25 ℃水浴10 min后，以空白管為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在595 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，測(cè)定各管OD值。以系列質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算牛血清白蛋白線性回歸方程。

微粒體樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：做標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定量的同時(shí)，另取試管加入2倍稀釋的微粒體懸液0.1 mL，每個(gè)樣品均做復(fù)管，以后操作同上，測(cè)定各樣品的OD值，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量，并換算成每克肝中所含的微粒體蛋白含量。

1.6.2 細(xì)胞色素P450含量 參照文獻(xiàn)[9]，取微粒體懸液0.3 mL 并加入0.1 mol/L PBS緩沖液5.7 mL(pH值7.4)于試管中，再加入0.1 g/mL連二亞硫酸鈉40 μL，立即混勻，靜置2 min，等量分裝到2個(gè)比色杯中，分別作為對(duì)照和樣本，向樣本杯中緩慢通入CO 60 s，穩(wěn)定2 min，以對(duì)照杯調(diào)400 nm向500 nm掃描，CYP450含量計(jì)算公式如下：

1.6.3 NADPH-細(xì)胞色素C還原酶活性 取微粒體懸液0.2 mL并加入0.1 mol/L PBS(含0.1 mmol/L EDTA)緩沖液5.6 mL、5 mg/mL細(xì)胞色素C溶液0.2 mL于試管中，混勻，等量分裝于對(duì)照杯和樣品杯。樣品杯內(nèi)加5 mg/mL NADPH溶液20 μL，立即混勻，550 nm處測(cè)定吸光度，秒表計(jì)時(shí)，每30 s測(cè)定一次OD值，連續(xù)測(cè)5 min，計(jì)算公式如下：

1.6.4 氨基比林-N-脫甲基酶(AND)活性 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別取0.1 mmol/L甲醛工作液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，各管用超純水補(bǔ)足至2.0 mL，加入Nash試劑2.0 mL，60 ℃水浴10 min，自來水冷卻，以空白管調(diào)零，420 nm處測(cè)定各管的吸光度，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，甲醛濃度為橫坐標(biāo)，繪制甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線。

AND活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]，取含250 mL/L甘油的KCl磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L KCl、0.1 mol/L PBS，pH值7.4)1.7 mL，加微粒體蛋白懸液0.1 mL，20 mg/mL氨基比林溶液0.1 mL 37 ℃水浴溫孵2 min后，測(cè)定管加10 mmol/L NADPH溶液0.1 mL，空白管加蒸餾水0.1 mL 37 ℃水浴30 min。各管均加150 g/L ZnSO40.35 mL，混勻，冰浴5 min，加飽和Ba(OH)20.35 mL，混勻，放置5 min后3 000 r/min離心5 min。取上清液2.0 mL加Nash試劑2.0 mL，以后操作同甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性，以甲醛的產(chǎn)生速度表示AND的活性[nmol/(mg·min) ]。

1.6.5 紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性 參照文獻(xiàn)[11]，在反應(yīng)體系中，紅霉素終濃度為0.4 mmol/L，其余步驟同氨基比林-N-脫甲基酶活性測(cè)定。

1.6.6 苯胺-4-羥化酶(AH)活性 4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別取50 μmol/L 4-氨基酚0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用60 g/L的TCA補(bǔ)足至1 mL，加10 mL/L的酚1 mL，混勻，加1 mol/L的碳酸鈉1 mL，混勻，室溫放置30 min，空白管調(diào)零，630 nm處測(cè)吸光度。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，4-氨基酚濃度為橫坐標(biāo)，繪制4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

AH活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]，取1 mmol/L NADPH溶液1 mL和鹽酸苯胺溶液0.5 mL，置于10 mL試管內(nèi)混勻，對(duì)照管加0.l mol/L PBS緩沖液(pH值7.4)1.0 mL取代NADPH溶液，37 ℃水浴2 min。各管加0.5 mL微粒體懸液，37 ℃水浴再溫孵30 min，加冰冷的200 g/L的TCA 1 mL終止酶反應(yīng)，冰浴5 min，11 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于另一試管，以后操作同4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性，以4-氨基酚的生成速度表示AH的活性[nmol/(mg·min)]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)：以一系列牛血清蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，OD595值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程：y=0.613x+0.001 9，r=0.999 3。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知牛血清蛋白質(zhì)量濃度和OD值線性關(guān)系良好，可用于肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定。

圖1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)：以一系列甲醛濃度作為橫坐標(biāo)，OD420值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程：y=3.700 1x-0.002 8，r=0.999 4。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知甲醛濃度和OD值線性關(guān)系良好，可用于反應(yīng)過程中4-氨基酚濃度的測(cè)定，間接測(cè)定AND活性。

圖2 甲醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)：以一系列4-氨基酚系列濃度作為橫坐，OD630值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程：y=0.010 3x-0.003 0，r=0.998 8。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知4-氨基酚濃度和OD值線性關(guān)系良好，可用于反應(yīng)過程中4-氨基酚濃度的測(cè)定，間接測(cè)定AH的活性。

圖3 4-氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 4種四環(huán)素類藥物對(duì)鯉肝微粒體蛋白及CYP450酶系含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表1。空白試驗(yàn)結(jié)果表明，該試驗(yàn)具有較好的重復(fù)性，可作為鯉肝微粒體酶CYP450酶系的檢測(cè)方法和用來探討研究藥物對(duì)肝微粒體酶CYP450酶系影響的研究方法。

空白對(duì)照組CYP450含量為(0.39±0.03)nmol/mg，OTC、TC、CTC和DOTC處理組CYP450含量分別為(0.22±0.02)、(0.28±0.02)、(0.21±0.03)、(0.25±0.03)nmol/mg，與空白對(duì)照組相比較具有極顯著差異；空白對(duì)照組NADPH-細(xì)胞色素C還原酶活性與4種四環(huán)素類藥物的活性差異不顯著；空白對(duì)照組AND活性為(1.27±0.09)nmol/(min·mg)，OTC、TC、CTC和DOTC處理組其活性分別為(0.86±0.09)、(0.79±0.05)、(0.84±0.05)、(0.86±0.06)nmol/(min·mg)，與空白對(duì)照組相比較差異極其顯著；空白對(duì)照組ERND活性為(0.85±0.04)nmol/(min·mg)，OTC、TC、CTC和DOTC處理組其活性分別為(0.63±0.03)、(0.57±0.02)、(0.49±0.04)、(0.52±0.02)nmol/(min·mg)，與空白對(duì)照組相比差異極其顯著；空白對(duì)照組AH活性為(0.034±0.001)nmol/(min·mg)，OTC、TC、CTC、DOTC處理組其活性分別為(0.026±0.004)、(0.027±0.003)、(0.025±0.004)、(0.028±0.004)nmol/(min·mg)，與空白對(duì)照組相比差異顯著。

表1 四環(huán)素類藥物對(duì)鯉肝微粒體蛋白及CYP450酶系含量的影響(n=12)

注：*表示與空白對(duì)照組具有顯著差異(P<0.05), **表示與空白對(duì)照組具有極顯著差異(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

藥物間相互作用可發(fā)生在吸收、分布、代謝和排泄4個(gè)階段，代謝性相互作用發(fā)生率較高，大約占藥物相互作用的40%[13]。在外源化合物的生物轉(zhuǎn)化中CYP450酶系起著非常重要的作用，其活性決定著藥物的代謝速率，是藥物相互作用的主要原因。藥物間相互作用70%是由酶的抑制作用引起的，其中酶抑制作用導(dǎo)致藥物相互作用的臨床意義大于酶的誘導(dǎo)作用[14]。

空白對(duì)照組和溶劑(二甲基亞砜)對(duì)照組測(cè)得的CYP450酶系的活性差異不顯著，說明本次試驗(yàn)選用的溶劑二甲基亞砜對(duì)鯉肝微粒體酶CYP450酶系的活性沒有影響?？瞻捉M數(shù)據(jù)表明，鯉在冬季水溫條件下肝藥酶CYP450酶系的含量及活性較其他魚類和動(dòng)物的活性偏低[15-16]，這可能是鯉的藥物代謝速率較其他魚類慢的原因。通過統(tǒng)計(jì)分析可以看出四環(huán)素類藥物OTC、TC、CTC、DOTC對(duì)鯉肝微粒體蛋白含量，細(xì)胞色素b5(CYPb5)的活性、NADPH-細(xì)胞色素C還原酶活性沒有明顯的影響，對(duì)CYP450含量，AND、ERND的活性具有顯著的抑制作用，該研究結(jié)果與作者研究的磺胺類藥物對(duì)鯉CYP450酶系的影響存在一定的差異[17]。試驗(yàn)結(jié)果說明四環(huán)素類藥物在一定程度上能夠抑制CYP450酶系的活性，部分藥物(與AND、ERND代謝相關(guān))在和四環(huán)素類藥物聯(lián)合使用時(shí)，其在鯉體內(nèi)的代謝會(huì)明顯受到抑制，甚至?xí)捎谒幬镩g相互作用出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)毒性反應(yīng)。

四環(huán)素類藥物為廣譜抗菌藥物，廣泛應(yīng)用于治療水產(chǎn)動(dòng)物革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌引起的感染。其主治由弧菌、嗜水氣單胞茵等細(xì)菌引起的魚類疾病。能有效地預(yù)防和治療養(yǎng)殖鯉魚的仔魚育苗期和商品魚養(yǎng)成期的腹水病，也可治愈多種細(xì)菌性病原造成的和不同地域發(fā)生的腹水病[18]。四環(huán)素類藥物在鯉養(yǎng)殖過程中使用廣泛，但本研究結(jié)果表明該類藥物對(duì)鯉CYP450酶系存在一定程度的抑制作用(AND、ERND活性)，因此其他藥物和四環(huán)素類藥物在鯉上同時(shí)使用時(shí)應(yīng)該格外慎重，防止出現(xiàn)藥物蓄積或毒性反應(yīng)。

綜上，CYP450酶的體內(nèi)試驗(yàn)和臨床藥物應(yīng)用試驗(yàn)存在一定的差異。因此，藥物與藥物之間的相互作用，以及解釋藥物之間配伍的科學(xué)理論依據(jù)需要進(jìn)行更加深入的研究。本試驗(yàn)可為探討四環(huán)素類藥物對(duì)鯉疾病控制過程中的合理使用提供理論基礎(chǔ)。