產(chǎn)生化黃腐酸菌株的篩選鑒定及應(yīng)用效果

張林利，王國文，劉 曄，姜 瑛，汪 強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002)

化肥是糧食增產(chǎn)的基礎(chǔ)，我國是人口眾多的農(nóng)業(yè)大國[1]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與化肥密切相關(guān)。近年來，我國化肥的使用呈現(xiàn)出明顯的總消費量大、利用率低的特點[2-3]，造成土壤污染、水污染、大氣污染等一系列的環(huán)境問題[4]，故發(fā)展綠色環(huán)保的新型肥料愈來愈被人們所重視。

生化黃腐酸(Biochemical fulvic acid，BFA)是指含有-COOH、-OH和 CH3O- 等活性基團(tuán)的各類小分子物質(zhì)、氨基酸、多元有機(jī)酸和維生素等組成成分十分復(fù)雜的腐植酸類[5]。BFA具有分子量低、易于吸收利用、生理活性較高、水溶性高、絮凝極限高、pH值接近中性、與微量元素有良好的相溶性等特點[6-7]，可以作為一種新型微生物菌肥，解決我國化肥使用所帶來的環(huán)境問題。BFA可由農(nóng)作物秸稈發(fā)酵制得。我國農(nóng)作物秸稈資源豐富，農(nóng)作物秸稈的不合理處置如焚燒、閑置等，不僅僅使農(nóng)作物秸稈等生物質(zhì)資源大量浪費，還引起嚴(yán)峻的環(huán)境污染等一系列問題[8]。玉米是我國第一大糧食作物，玉米秸稈產(chǎn)出量約占我國農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)出量的近1/3[9-10]。以玉米秸稈為原料發(fā)酵制取BFA，既是對農(nóng)業(yè)秸稈等生物質(zhì)資源的有效利用，又為新型微生物菌肥的制備奠定了基礎(chǔ)，在維護(hù)地球生態(tài)、提高農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展等方面具有十分重要的意義[11-13]。

近些年，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對BFA在應(yīng)用方面的研究較多[14-18]，但利用農(nóng)作物秸稈發(fā)酵生產(chǎn)BFA及BFA發(fā)酵菌株選育方面的研究幾乎未有涉及。為此，從砂質(zhì)潮土中篩選出能夠發(fā)酵生產(chǎn)BFA且效果較好的菌株，并以玉米秸稈為原料進(jìn)行所篩選菌株的發(fā)酵試驗，發(fā)酵結(jié)束后將其固體發(fā)酵產(chǎn)物施于大田中，與市場已有的BFA肥料相比較，以驗證發(fā)酵產(chǎn)物的效果，旨在為我國農(nóng)作物秸稈等生物質(zhì)資源的高效利用、新型生物肥料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 值7.0～7.2，1×105Pa滅菌20 min。

擴(kuò)大培養(yǎng)基：不加瓊脂，其他同LB培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基:發(fā)酵原料為玉米秸稈，pH值自然[19]。

1.1.3 黃腐酸(FA)肥料及作物 FA肥料由Shanghai EKEAR Bio@Tech Co.LTD提供。供試作物為玉米。

1.2 產(chǎn)BFA菌株的篩選、鑒定

在實驗室內(nèi)，將所取土樣制成土壤菌懸液，并按10倍梯度稀釋法將懸浮液稀釋至10-6，將不同濃度的懸浮液涂布在 LB平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，分離純化出不同菌株[20]。然后將所篩菌株用擴(kuò)大培養(yǎng)基在搖床上180 r/min、30 ℃培養(yǎng)1 d。將菌液與滅菌骨粉以1∶1的比例混合后發(fā)酵，之后晾曬1～3 d，制成固體菌劑，以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，設(shè)置不添加菌劑的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(CK)，最后以產(chǎn)物中的FA(腐植酸的重要組分之一)含量作為判定指標(biāo)，以判定該菌株能否發(fā)酵生產(chǎn) BFA。然后通過形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA序列比對分析對菌株進(jìn)行綜合鑒定[21-25]。

1.3 產(chǎn)BFA菌株的應(yīng)用效果

試驗以玉米秸稈(含水率控制在50%左右)為發(fā)酵原料，固體菌劑接種量為2%，尿素(氮源)添加量為2%，發(fā)酵時間為25 d，堆置于發(fā)酵池的上層進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用效果試驗共設(shè)7個處理，即 T1(不施加任何發(fā)酵產(chǎn)物)、T2(施加 YC8發(fā)酵產(chǎn)物)、T3( 施加 YM3發(fā)酵產(chǎn)物)、T4(施加 HS3發(fā)酵產(chǎn)物)、T5(施加 HS4發(fā)酵產(chǎn)物)、T6(施加 YC4發(fā)酵產(chǎn)物)、T7(施加市售商品FA肥料)，小區(qū)面積為4×4=16 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，每個處理3個重復(fù)。

肥料施用方法：氮肥選用尿素，磷肥選用過磷酸鈣(含P2O512%)，鉀肥選用硫酸鉀(含K2O 50%)，施用量分別為210、120、75 kg/hm2。氮肥1/2在苗期溝施，1/2在大喇叭口期穴施，磷、鉀肥在苗期一次性溝施，各發(fā)酵產(chǎn)物和商品BFA肥料與氮肥同時施用(每次100 kg/hm2)。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 FA含量 用重鉻酸鉀容量法測定[26]

在充分發(fā)揮機(jī)械化作用下挖運土石料，既要確保合理布置工作面，還要使車廂與鏟斗具有合理的容量比值，可按照表1參數(shù)值制定具體挖運方案。

1.4.2 土壤養(yǎng)分含量 土壤速效磷含量采用Olsen法測定；土壤速效鉀含量采用中性CH3COONH4浸提—火焰光度法測定。

1.4.3 植株養(yǎng)分含量 玉米植株全氮含量采用AA3流動注射分析儀測定；玉米植株全磷含量采用鉬藍(lán)比色法測定[27]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

分別采用SPSS 20.0、Excel 2010和OriginPro 8.5進(jìn)行方差分析和制圖,用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)BFA菌株的篩選、鑒定

從所采集土壤中共分離純化出菌株18株，然后將分離純化的18株菌分別制成固體菌劑，以2%的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，以產(chǎn)物中FA含量作為判定指標(biāo)，最終得到7株發(fā)酵效果較好的菌株，分別命名為YC8、YM3、HS3、HS10、YM4、HS4和YC4。由定量數(shù)據(jù)可知(圖1)，HS4菌株的產(chǎn) BFA能力最強(qiáng)，F(xiàn)A含量可達(dá)到20.91%，比CK增加287.94%，顯著高于其他菌株的發(fā)酵結(jié)果。YM3菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中FA含量達(dá)13.65%，比CK (5.39%)增加153.25%。以篩選出的YC8、YM3、HS3、HS4、YC4 五株產(chǎn)BFA效果較好的菌株進(jìn)行大田應(yīng)用效果研究。

不同小寫字母表示不同處理之間的差異顯著(P<0.05)圖1 不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物中FA含量的比較

對上述效果較好的5株菌株通過形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YC8、YM3、HS3、HS4、YC4分別為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、酸快生芽孢桿菌(Bacillusacidiceler)、壁芽孢桿菌(Bacillusmuralis)、彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)[21-25]，將其序列號在 NCBI上比對上傳獲得登錄號分別為KP743128、KP743130、KP743120、KP743121、KP743125。

2.2 產(chǎn)BFA菌株的應(yīng)用效果

2.2.1 產(chǎn)BFA菌株發(fā)酵產(chǎn)物對土壤速效養(yǎng)分含量的影響 由圖2可知，在玉米五葉期，7個處理的土壤速效磷含量之間的差異不顯著，T3、T4、T5、T6處理高于T1處理，且T3、T5、T6處理相對較高；在大喇叭口期，T2—T7處理土壤速效磷含量均較T1處理增加，其中T3、T7處理差異顯著，以T7處理最高，隨后依次為T3、T6處理，T3、T4、T5、T6、T7處理之間的差異不顯著，T3處理顯著高于T2處理；在成熟期，T2—T7處理土壤速效磷含量均較T1處理增加，其中T3、T5、T6、T7處理差異顯著，分別比T1處理提高了32.45%、20.44%、15.32%、24.35%，以T3處理最高，隨后依次為T7、T5處理，T3處理較T7處理提高6.51%。

由圖2可知，在玉米五葉期，T2—T7處理土壤速效鉀含量均較T1處理增加，其中T2、T3、T7處理差異顯著，分別比T1處理提高28.35%、34.57%、42.62%，T7處理顯著高于T2處理，T3處理與T2、T7處理之間的差異均未達(dá)到顯著水平；大喇叭口期，7個處理的土壤速效鉀含量之間的差異不顯著，T2—T7處理均較T1處理有所增加，以T5處理最高，較T1處理增加了1.94%，隨后依次為T4、T2處理；在成熟期，T2—T7處理土壤速效鉀含量均較T1處理增加，其中T2、T6處理差異顯著，分別較T1處理提高了17.47%、20.37%，T2處理較T7處理提高7.40%。

綜上，T3處理對增加土壤速效磷含量作用明顯，T2處理對增加土壤速效鉀含量作用明顯。

同一時期不同小寫字母表示不同處理之間的差異顯著(P<0.05)圖2 產(chǎn)BFA菌株發(fā)酵產(chǎn)物對土壤速效養(yǎng)分含量的影響

2.2.2 產(chǎn)BFA菌株發(fā)酵產(chǎn)物對玉米產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響 由表1可知，與 T1處理相比，T2—T7處理的玉米穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量均略有增加，但差異不顯著，穗粒數(shù)以T6處理最高，較 T1處理提高了9.12%；千粒質(zhì)量以T7處理最高，隨后依次為T3、T5處理。與T1處理相比，T2—T7處理的玉米產(chǎn)量均顯著增加，T7處理最高，然后依次為T4、T6處理，分別較T1處理增加14.19%、13.39%、11.79%；除T5處理顯著低于T7處理外，其余處理均與T7處理差異不顯著。

表1 產(chǎn)BFA菌株發(fā)酵產(chǎn)物對玉米產(chǎn)量及其 構(gòu)成因素的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理之間的差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2.3 產(chǎn)BFA菌株發(fā)酵產(chǎn)物對玉米植株地上部干質(zhì)量和氮、磷積累量的影響 不同處理對玉米植株地上部干質(zhì)量和氮、磷積累量的影響如表2所示，在所有時期，均表現(xiàn)為T2—T7處理玉米植株地上部干質(zhì)量和氮、磷積累量高于T1處理。

在五葉期，對植株地上部干質(zhì)量來說，T3、T6處理效果較好，分別比T1處理顯著增加57.15%、49.05%，且與T7處理之間的差異不顯著；對地上部氮素積累量來說，T2、T4處理效果較好，且效果優(yōu)于T7處理；對地上部磷素積累量來說，T5處理效果最好，與T1處理之間的差異達(dá)到顯著水平，與T7處理之間的差異不顯著。

在大喇叭口期，對植株地上部干質(zhì)量來說，T2、T3、T4、T6處理效果較好，分別較T1處理顯著增加14.77%、13.64%、26.79%、23.27%，同時顯著低于T7處理；對地上部氮素積累量來說，T3、T5、T6處理效果較好，均與T7處理之間的差異不顯著，同時顯著高于T1處理；對地上部磷素積累量來說，T2、T4處理效果較好，分別較T1處理顯著增加22.82%、24.47%，且與T7處理之間的差異不顯著。

在成熟期，對植株地上部干質(zhì)量來說，T2處理效果最好，較T1處理顯著增加38.57%，與T7處理之間的差異不顯著；對地上部氮素積累量來說，T3、T5處理效果較好，分別較T1處理顯著增加8.71%、13.30%，與T7處理之間的差異不顯著；對地上部磷素積累量來說，T5處理效果最好，較T1處理顯著增加16.04%，與T7處理之間的差異不顯著。

總體上，T2、T3、T4、T6處理對增加植株地上部干質(zhì)量的作用明顯，T2、T3、T5處理對增加植株地上部氮素積累量的作用明顯，T2、T4、T5處理對增加植株地上部磷素積累量的作用明顯。

表2 不同處理對玉米植株地上部干質(zhì)量及氮素、磷素積累量的影響 kg/hm2

3 結(jié)論與討論

BFA在農(nóng)作物方面的應(yīng)用具有多個優(yōu)點，袁瑞江等[28]研究表明，BFA能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育，增強(qiáng)植物抗逆性，改善產(chǎn)品品質(zhì)等。BFA可由農(nóng)作物秸稈利用微生物發(fā)酵制得，王連棋等[29]研究表明，微生物在秸稈發(fā)酵腐解過程中不斷進(jìn)行分解代謝和合成代謝，有機(jī)物可被分解成無機(jī)態(tài)的氮、磷、鉀等較小的分子物質(zhì)，而小分子營養(yǎng)物質(zhì)有利于植物的生長。

土壤速效養(yǎng)分指植物根系可直接吸收加以利用的養(yǎng)分形態(tài)，是農(nóng)作物獲得高產(chǎn)的保證。本研究結(jié)果表明，施加YM3發(fā)酵產(chǎn)物處理對增加土壤速效磷含量效果明顯，施加YC8發(fā)酵產(chǎn)物處理對增加土壤速效鉀含量效果明顯，這與司小明[30]的研究結(jié)果類似。施加 HS3發(fā)酵產(chǎn)物處理對增加玉米產(chǎn)量效果最好，隨后依次為施加YC4、YM3發(fā)酵產(chǎn)物處理，這與魯宇菡等[31]的研究結(jié)果相似。

植株中的氮、磷含量反映玉米植株的營養(yǎng)狀況。本試驗中總體上施加 HS3發(fā)酵產(chǎn)物處理對玉米植株地上部干質(zhì)量的增加效果最好，施加YM3發(fā)酵產(chǎn)物處理使植株地上部氮素積累量較對照顯著增加，施加HS4發(fā)酵產(chǎn)物處理使植株地上部磷素積累量較對照顯著增加，這與沈訥敏[32]研究結(jié)果類似。

綜上，本試驗中共篩選出發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)BFA效果較好的5株菌株，分別命名為YC8、YM3、HS3、HS4、YC4。經(jīng)形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5株菌分別為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、酸快生芽孢桿菌(Bacillusacidiceler)、壁芽孢桿菌(Bacillusmuralis)、彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。大田試驗結(jié)果表明，所篩選出的5株菌均能不同程度地增加土壤速效養(yǎng)分、玉米產(chǎn)量、地上部養(yǎng)分含量等，且大部分與市售商品黃腐酸肥料的應(yīng)用效果無顯著差異，甚至個別菌株優(yōu)于市售商品黃腐酸肥料的應(yīng)用效果。該結(jié)果在發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)BFA新型生物肥料方面有較大的應(yīng)用潛力。