菊葉香藜精油合成關(guān)鍵HMGR基因的 生物信息學(xué)分析

付蘇宏，雷 鳴，張勇群，施 靜，郝豆豆

(西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院 分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

菊葉香藜(Dysphaniaschraderiana)為藜科1年生草本植物，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，廣泛生存于青藏高原草甸，此外也生長(zhǎng)于海拔2 700～4 500 m的山坡、村邊、河灘等[1]。菊葉香藜生長(zhǎng)于輻射強(qiáng)、溫差大的高原環(huán)境中，具有較好的極端環(huán)境耐受力，可用于改善生態(tài)環(huán)境[2]。此外，菊葉香藜具有廣泛的藥理活性，《藏藥志》記載菊葉香藜具有抗腫瘤活性[3]，全草入藥可清熱解毒，用于治療感冒、頭疼、皮膚瘙癢等[4]。菊葉香藜因含有揮發(fā)油而具有強(qiáng)烈的氣味，因此對(duì)其精油的研究也日益增多。石夢(mèng)菲[5]研究發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油可抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)；雷鳴等[6]發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油可顯著抑制玉米象活力；劉志龍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油在防治螨蟲(chóng)方面具有顯著效果，現(xiàn)已申請(qǐng)專(zhuān)利。石夢(mèng)菲等[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對(duì)菊葉香藜精油成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菊葉香藜精油的主要成分為脂肪族化合物(54.232%)、萜類(lèi)化合物及其含氧衍生物(31.945%)，其中單萜類(lèi)化合物和倍半萜類(lèi)化合物含量較高，主要萜類(lèi)化合物有α-杜松醇(α-Cadinol，13.966%)、四甲基環(huán)癸二烯甲醇(Hedycaryol，11.164%)和δ-杜松烯(δ-Cadinene，7.292%)，均為倍半萜類(lèi)化合物。

高等植物萜類(lèi)化合物的前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸(IPP)可通過(guò)發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑和發(fā)生在質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑合成，IPP及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)經(jīng)過(guò)下游多種酶的催化發(fā)生結(jié)合、縮合、修飾等方式生成結(jié)構(gòu)多樣的萜類(lèi)化合物[8-9]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)是MVA途徑中的第一個(gè)限速酶，目前，小麥[10]、甘草[11]、擬南芥[12]、杜仲[13]、蘋(píng)果[14]、人參[15]等多個(gè)植物的HMGR基因已經(jīng)被克隆。本研究針對(duì)菊葉香藜萜類(lèi)化合物合成中的關(guān)鍵酶HMGR進(jìn)行深入剖析，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)菊葉香藜HMGR基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，旨在為菊葉香藜精油生物合成的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菊葉香藜HMGR基因序列來(lái)源于菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)過(guò)比對(duì)和功能注釋得到的候選基因序列(本實(shí)驗(yàn)室前期研究)，命名為DsHMGR，已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)：MG582592)；試驗(yàn)中所涉及到的其他氨基酸序列均來(lái)源于NCBI(National center for biotechnology information)中已登錄的數(shù)據(jù)序列，相關(guān)信息如表1所示。

表1 物種信息匯總

1.2 分析方法

運(yùn)用GenBank的在線軟件ORF Finder和本地軟件Jellyfish 2.0查找開(kāi)放閱讀框(ORF)；利用在線軟件ProtParam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運(yùn)用在線分析軟件ProtScale分析蛋白質(zhì)親/疏水性；運(yùn)用在線SOPMA軟件分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用在線工具SignalP 4.1分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽；利用在線程序TMHMM進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)；運(yùn)用在線軟件Cell-PLoc 2.0分析蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；采用在線工具CDD(Conserved domain datebase)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)以人類(lèi)HMGR蛋白(PDB ID:3CD0)為模板，利用Phyre2進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模；利用本地軟件Clustalx進(jìn)行多條氨基酸序列比對(duì)；利用本地軟件MEGA 5.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，相關(guān)在線生物信息學(xué)分析軟件如表2所示[16]。

表2 生物信息學(xué)在線分析軟件匯總

2 結(jié)果與分析

2.1 菊葉香藜DsHMGR基因序列分析

DsHMGR基因序列全長(zhǎng)1 986 bp，GC含量為0.504，ORF Finder預(yù)測(cè)結(jié)果表明，DsHMGR包含一段157 bp的5′端非翻譯區(qū)、一段104 bp的3′端非翻譯區(qū)以及一段1 725 bp的開(kāi)放閱讀框，開(kāi)放閱讀框?yàn)?58—1882位，編碼574個(gè)氨基酸(圖1)，與已報(bào)道的植物HMGR基因堿基數(shù)和編碼氨基酸殘基數(shù)基本一致。

圖1 菊葉香藜DsHMGR基因及所編碼蛋白質(zhì)序列

2.2 菊葉香藜DsHMGR蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ProtParam對(duì)DsHMGR蛋白和3種已公布的藜科植物HMGR蛋白進(jìn)行分析，并比較它們的理化性質(zhì)和氨基酸組成(表3)。4種HMGR蛋白的氨基酸長(zhǎng)度為574～581 aa，分子質(zhì)量61.68～62.51 ku，等電點(diǎn)(pI值)6.30～7.89，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，各類(lèi)氨基酸的組成基本一致，無(wú)明顯差別，非極性氨基酸為主要氨基酸，比例為44.6%～45.9%。其中DsHMGR分子質(zhì)量61.77 ku，pI值為7.46，不穩(wěn)定系數(shù)為49.25，大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。此外，DsHMGR蛋白中非極性氨基酸所占比例最大，其比例達(dá)到了45.8%；極性中性氨基酸的比例也較高，為32.4%；酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例相當(dāng)，分別為10.3%和11.5%。DsHMGR蛋白中含量最多的氨基酸依次為亮氨酸(Leu，9.9%)、絲氨酸(Ser，9.6%)、丙氨酸(Ala，9.1%)和纈氨酸(Val，8.5%)，含量最低的為色氨酸(Trp，0.3%)。

表3 藜科植物HMGR蛋白的理化性質(zhì)及氨基酸組成

2.3 菊葉香藜DsHMGR蛋白親/疏水性分析

蛋白質(zhì)的疏水氨基酸殘基由于水的作用會(huì)相互靠近，形成一個(gè)疏水內(nèi)核和親水表面。蛋白質(zhì)的疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，發(fā)揮著維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要作用。利用在線軟件ProtScale對(duì)DsHMGR蛋白進(jìn)行親/疏水性預(yù)測(cè)。正值表示疏水，其絕對(duì)值越大表示越疏水；負(fù)值表示親水，其絕對(duì)值越大表示越親水；介于-0.5～+0.5主要表示為兩性氨基酸。DsHMGR蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2所示，在N端具有2個(gè)明顯的疏水峰，分別位于40—58位和73—103位區(qū)域，提示在這2個(gè)位置可能有跨膜結(jié)構(gòu)。在DsHMGR蛋白多肽鏈的第51位處有最高分值 3.122，其疏水性水性較強(qiáng)；第6位有最小分值-2.844，其親水性較強(qiáng)。

圖2 DsHMGR蛋白的親/疏水性分析

2.4 菊葉香藜DsHMGR蛋白信號(hào)肽分析

信號(hào)肽是一段含有15～30個(gè)氨基酸殘基的短肽，位于分泌蛋白的N端，主要包括3個(gè)區(qū)域：帶正電的N末端區(qū)域、疏水的主要功能區(qū)域以及較長(zhǎng)的帶負(fù)電的C末端區(qū)域。在分泌蛋白合成結(jié)束后，其N(xiāo)端的信號(hào)肽將被切除。利用在線軟件SignalP 4.1對(duì)DsHMGR蛋白的信號(hào)肽及其位置進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。典型的信號(hào)肽具有較高的S值,在剪切點(diǎn)位點(diǎn)處有最大的C值，Y值有最高峰。由圖3知，DsHMGR蛋白的S值較小，C值未出現(xiàn)一個(gè)明顯的最大值，Y值也未發(fā)現(xiàn)有最高峰，均不具有信號(hào)肽的特點(diǎn)，由此可推斷DsHMGR蛋白不含有信號(hào)肽，為非分泌性蛋白。

圖3 DsHMGR蛋白的信號(hào)肽分析

2.5 菊葉香藜DsHMGR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位分析

在蛋白質(zhì)中，20個(gè)左右的氨基酸殘基所形成的α螺旋，與生物膜的脂質(zhì)雙分子層相互作用，將蛋白質(zhì)錨定在生物膜中，這樣的結(jié)構(gòu)即跨膜結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件TMHMM分析DsHMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，如圖4示，在N端存在2個(gè)概率約為1的最大峰，即2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸序列的37—59位和80—102位區(qū)域。同時(shí)運(yùn)用在線軟件Cell-PLoc 2.0對(duì)DsHMGR蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsHMGR蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。此外，在DsHMGR蛋白的氨基酸序列的C端發(fā)現(xiàn)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的定位信號(hào)序列KKVL基序(412—415位)，進(jìn)一步確證DsHMGR蛋白是定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。因此推斷菊葉香藜的DsHMGR蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，通過(guò)N端的2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)將HMGR錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，C端則延伸至細(xì)胞質(zhì)中。

圖4 DsHMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.6 菊葉香藜DsHMGR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由肽鏈主鏈骨架原子所構(gòu)成的局部空間結(jié)構(gòu)，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，空間上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)可協(xié)同完成特定的功能。利用SOPMA在線軟件對(duì)DsHMGR蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示，在DsHMGR蛋白的整個(gè)肽鏈中均分布有α-螺旋，是DsHMGR蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，散布于整個(gè)肽鏈中，所占比例41.64%；其次為無(wú)規(guī)則卷曲，所占比例35.89%；延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別為15.85%和6.62%。

h代表α-螺旋； e代表延伸鏈； t代表β-轉(zhuǎn)角； c代表無(wú)規(guī)則卷曲圖5 DsHMGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.7 菊葉香藜DsHMGR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與空間結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI的CDD查找DsHMGR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，DsHMGR蛋白歸屬于HMGR家族，存在HMGR蛋白特征保守活性位點(diǎn)：具有催化功能的4個(gè)氨基酸殘基Glu(253)、Lys(385)、Asp(461)、His(559)；2個(gè)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)EMPVGFIQIP(221—231位)和TTEGCLVA(251—258位)；2個(gè)NAD(P)H結(jié)合位點(diǎn)DAMGMNM(347—353位)和GTVGGGT(496—502位)。在DsHMGR蛋白與其他物種HMGR蛋白的氨基酸序列比對(duì)(圖6)中，DsHMGR蛋白與其他植物HMGR蛋白在C端和中間區(qū)域氨基酸序列保守性較高，HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)和NAD(P)H結(jié)合位點(diǎn)作為植物HMGR重要的功能結(jié)構(gòu)域保守性也較高；而在HMGR蛋白的N端，除跨膜區(qū)域的保守性相對(duì)較高，其余區(qū)域的氨基酸序列則在數(shù)量和種類(lèi)上均存在較大差異，預(yù)示著DsHMGR蛋白與其他物種HMGR蛋白具有相同的催化功能，但細(xì)胞定位與調(diào)控可能不同。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)功能，因此對(duì)其進(jìn)行深入研究具有重要指導(dǎo)意義。利用線串法，將DsHMGR基因所編碼的氨基酸序列提交在線三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Phyre2，結(jié)果顯示，DsHMGR蛋白與人類(lèi)HMGR蛋白(PDB ID:3CD0)具有56%的序列相似性，以該人類(lèi)HMGR蛋白為模板，通過(guò)同源建模構(gòu)建DsHMGR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，其結(jié)果如圖7所示。與大多數(shù)植物的HMGR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，DsHMGR蛋白具有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N-結(jié)構(gòu)域、L-結(jié)構(gòu)域和S-結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)位于N-結(jié)構(gòu)域內(nèi)，HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)位于L-結(jié)構(gòu)域內(nèi)，NAD(P)H結(jié)合位點(diǎn)位于S-結(jié)構(gòu)域內(nèi)。HMG-CoA、NAD(P)H與DsHMGR蛋白結(jié)合后，Glu(253)、Lys(385)、Asp(461)、His(559)4個(gè)氨基酸殘基發(fā)揮催化功能，首先由NAD(P)H和質(zhì)子化的Lys(385)提供兩分子H生成3-羥基-3-甲基-5-羧基戊醛輔酶A基單硫縮醛(Mevaldyl-CoA)和NAD(P)+，然后Mevaldyl-CoA脫去一分子HSCoA生成3-羥基-3-甲基-5-醛基戊酸(Mevaldehyde)，最后NAD(P)H和質(zhì)子化的His(559)為Mevaldehyde提供兩分子H生成甲羥戊酸(Mevalonate)和NAD(P)+(圖8)。

圖6 HMGR蛋白多序列比對(duì)分析

2.8 菊葉香藜DsHMGR蛋白進(jìn)化分析

選取14條來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的HMGR蛋白序列，其物種信息詳見(jiàn)表1，利用本地軟件MEGA 5.0對(duì)DsHMGR蛋白和這14條HMGR蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用Neighbor-joining法構(gòu)建HMGR分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行聚類(lèi)關(guān)系分析，其結(jié)果如圖9所示。整個(gè)進(jìn)化樹(shù)聚為兩大支，真菌靈芝單獨(dú)聚為一支，植物聚為一支。在植物分支中，單子葉植物和雙子葉植物又各自聚為一支，雙子葉植物中大戟科、五加科、葫蘆科、菊科、藜科各自聚為一支，具有明顯的種族特異性。菊葉香藜與藜科植物位于同一分支中，說(shuō)明菊葉香藜與藜科植物的親緣關(guān)系最近。

圖7 DsHMGR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)

圖8 DsHMGR蛋白的催化機(jī)制

圖9 HMGR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論與討論

植物的次生代謝產(chǎn)物在其生命活動(dòng)和環(huán)境適應(yīng)等諸多方面發(fā)揮著重要作用，除此以外，在植物次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種具有藥用價(jià)值的化合物，如紫杉醇、青蒿素等。目前，探索植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制以及挖掘、分析相關(guān)的酶基因已成為植物次生代謝產(chǎn)物研究的重要內(nèi)容[15]。菊葉香藜精油表現(xiàn)出顯著的抑菌活性和殺蟲(chóng)活性，其主要成分為萜類(lèi)化合物。目前對(duì)菊葉香藜的研究?jī)H限于其提取方法的優(yōu)化和藥理活性，其分子生物學(xué)方面的研究還很缺乏，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘、發(fā)現(xiàn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因是闡明次生代謝途徑及調(diào)控機(jī)制的重要途徑[17]。

MVA途徑是植物合成萜類(lèi)化合物前體的兩大途徑之一，該途徑的第1個(gè)關(guān)鍵限速酶是HMGR，植物單萜、倍半萜、二萜、三萜類(lèi)等活性成分的生物合成均需該酶的參與，通過(guò)調(diào)節(jié)該酶的表達(dá)可以決定各種萜類(lèi)終產(chǎn)物的產(chǎn)量和比例，因此HMGR可作為萜類(lèi)化合物代謝的重要調(diào)控位點(diǎn)，近年來(lái)，HMGR的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制備受關(guān)注[16]。由此本研究對(duì)菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行挖掘，研究結(jié)論如下：(1)獲得了1條HMGR基因全長(zhǎng)序列，編碼574個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的植物HMGR氨基酸殘基數(shù)相差不大，非極性氨基酸為主要氨基酸，亮氨酸(Leu，9.9%)為含量最多的氨基酸。(2)對(duì)菊葉香藜DsH-MGR蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，DsHMGR蛋白不含信號(hào)肽，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，在N端具有 2個(gè)疏水區(qū)域，含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的定位信號(hào)均顯示DsHMGR蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與大多數(shù)植物一致[18-19]。(3)DsHMGR蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲穿插其中，在空間結(jié)構(gòu)上則折疊為“V”形，具有N、L和S 3個(gè)催化活性中心結(jié)構(gòu)域，具有4個(gè)催化氨基酸殘基(253Glu、385Lys、461Asp、559His)，以及2個(gè)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)(EMPVGFIQIP和TTEGCLVA)和2個(gè)NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)(DAMGMNM和GTVGGGT)，與其他植物具有相同的催化活性[20-22]。(4)DsHMGR蛋白與其他植物HMGR蛋白氨基酸序列比對(duì)也顯示，HMGR蛋白在C端和連接區(qū)具有較高保守性，在N端的序列保守性較低。(5)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，菊葉香藜與藜科植物聚為一支，表明其親緣關(guān)系較近。菊葉香藜萜類(lèi)化合物合成關(guān)鍵酶HMGR的生物信息學(xué)分析，為今后研究菊葉香藜HMGR蛋白的功能、構(gòu)建表達(dá)載體、萜類(lèi)化合物的生物合成分子機(jī)制研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。