病毒誘導(dǎo)的基因沉默在茄科植物基因功能研究中的應(yīng)用進(jìn)展

曲 玲，李彥龍，安 巍，焦恩寧，趙建華，劉蘭英，秦 墾，曹有龍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 枸杞工程技術(shù)研究所/國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

茄科(Solanaceae)植物約80屬3 000種，在全世界熱帶和溫帶地區(qū)廣泛分布，中國(guó)有24屬115種[1]。茄科植物中有許多種類是世界性的經(jīng)濟(jì)作物，與人類生活密切相關(guān)，如番茄、煙草、辣椒、馬鈴薯等，還有一些具有藥用價(jià)值，如枸杞、顛茄等。近5 a來(lái)，隨著完成基因組測(cè)序工作的茄科植物種類的增加，迫切需要對(duì)基因組中大量序列已知但功能未知的預(yù)測(cè)基因的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證和鑒定。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是利用RNA介導(dǎo)的植物防御病毒免疫機(jī)制而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)詮釋植物基因功能的反向遺傳學(xué)技術(shù)，其內(nèi)在的分子基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)。其相比于以往的基因功能鑒定方法，如化學(xué)誘導(dǎo)突變及輻射突變、T-DNA插入突變、圖位克隆等技術(shù)，具有不需要建立植物遺傳轉(zhuǎn)化體系、可沉默基因家族、操作簡(jiǎn)單且周期短、重復(fù)性高和沉默效率高等優(yōu)點(diǎn)[2]，適合植物基因的高通量功能分析，其無(wú)需具備清楚的遺傳背景，無(wú)需構(gòu)建和篩選轉(zhuǎn)基因株系，因此，近年來(lái)廣泛地用于模式和非模式植物基因的功能分析領(lǐng)域。

自1995年Kumagai等[3]基于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)構(gòu)建了第一個(gè)VIGS載體(TMV-PDS)并侵染煙草產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象以來(lái)，VIGS技術(shù)在茄科植物中的應(yīng)用已有20多年，在煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒、矮牽牛和枸杞等中均得到成功運(yùn)用，鑒定或驗(yàn)證了包括次生代謝產(chǎn)物合成和調(diào)控通路、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病蟲(chóng)與非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的多種基因的功能，筆者就近年來(lái)VIGS技術(shù)在茄科植物功能基因挖掘中的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，旨在為相關(guān)研究提供借鑒。

1 VIGS的作用原理和發(fā)展

van Kammen最早使用VIGS一詞來(lái)描述植物防御病毒侵染后的恢復(fù)現(xiàn)象[4]，現(xiàn)在已被研發(fā)成為利用構(gòu)建插入目的基因片段的重組病毒載體，沉默植物內(nèi)源基因的技術(shù)[5]，其作用機(jī)制是一種由RNA介導(dǎo)的植物防御機(jī)制(RNA-mediated defense，RMD)，與轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象相關(guān)[6]。當(dāng)病毒侵染植物體后，在植物體內(nèi)或病毒自身依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRP)作用下[7]，合成積累雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)啟動(dòng)PTGS，這些dsRNA被一種稱為DICER-like的RNaseⅢ樣的核酸內(nèi)切酶切成21～24 nt的小分子量干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)，siRNA被RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC，由Argonaute蛋白、內(nèi)切酶、解旋酶等組成)所識(shí)別解離成單鏈后，組合成為RISC的主要成員，作為模板通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形式指導(dǎo)復(fù)合體切割與siRNA同源的病毒mRNA，使該mRNA降解[8]。

利用植物對(duì)病毒侵染的這種天然免疫防御機(jī)制，在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒雙元載體中重組帶有多克隆位點(diǎn)的病毒基因組cDNA，在此基礎(chǔ)上，克隆植物待沉默內(nèi)源基因片段，插入該載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建得到基因沉默病毒載體，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染寄主植物后，同樣會(huì)激發(fā)RNA介導(dǎo)的植物防御機(jī)制，特異性地抑制寄主植物細(xì)胞中與該外源插入基因片段一致或與之同源的內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)積累[9]，從而導(dǎo)致植物內(nèi)源目標(biāo)基因功能缺失或表達(dá)水平受抑制，植物體呈現(xiàn)出與靶基因相關(guān)的生理生化途徑發(fā)生改變的性狀，通過(guò)觀察突變表型或測(cè)定相關(guān)的生理生化指標(biāo)變化可有效鑒定該內(nèi)源目標(biāo)基因的功能[10]。另外，作為VIGS過(guò)程中的可移動(dòng)的信號(hào)分子，序列特異性的siRNA還可在RdRP作用下進(jìn)行擴(kuò)增，形成新的次級(jí)siRNA，在韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播，使遠(yuǎn)離侵染位點(diǎn)的植物組織發(fā)生系統(tǒng)性的基因沉默[11]。Mermigka等[12]推測(cè)24 nt的siRNA最有可能是長(zhǎng)距離傳輸?shù)男盘?hào)分子。另外大量結(jié)果表明，21 nt的siRNA通過(guò)胞間連絲進(jìn)行短距離傳播[13]。目前VIGS技術(shù)已經(jīng)成為通過(guò)暫時(shí)沉默目的基因而驗(yàn)證和鑒定植物基因功能的一種強(qiáng)有力的技術(shù)工具。

2 茄科植物中VIGS載體的開(kāi)發(fā)和改良

利用DNA重組技術(shù)，源于多種植物病毒的VIGS沉默載體被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，這些載體許多在茄科植物上得到成功運(yùn)用(表1)。

表1 茄科植物基因功能研究中的VIGS載體

續(xù)表1 茄科植物基因功能研究中的VIGS載體

續(xù)表1 茄科植物基因功能研究中的VIGS載體

續(xù)表1 茄科植物基因功能研究中的VIGS載體

其中主要包括：正鏈RNA病毒，比如馬鈴薯X病毒、煙草脆裂病毒、煙草花葉病毒等單分體或雙分體病毒[8,66]；雙生病毒科的單鏈DNA病毒，其含有單組分或雙組分DNA，如甜菜曲頂病毒[59]、番茄金色花葉病毒[52]、非洲木薯花葉病毒[54]、番茄曲葉病毒[30]和瓦斯蒂克辣椒黃脈病毒[65]等環(huán)狀單鏈DNA病毒。另外還有一種由RNA病毒的衛(wèi)星病毒或單組分雙生病毒的衛(wèi)星DNA構(gòu)建的VIGS載體，如Gosselé等[31]利用煙草花葉病毒U2株系(TMV-U2)和其伴隨衛(wèi)星病毒(STMV)建立的衛(wèi)星病毒誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)(Satellite virus-induced silencing system，SVISS)，該系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于將病毒的復(fù)制運(yùn)動(dòng)組分與沉默誘導(dǎo)組分相分離，使得系統(tǒng)的基因沉默效果更加高效和穩(wěn)定。衛(wèi)星DNA主要有中國(guó)番茄黃化曲葉病毒的衛(wèi)星核酸DNAβ[32]，貝因迪黃脈花葉病毒衛(wèi)星DNAβ[50]，其優(yōu)點(diǎn)在于衛(wèi)星DNAβ的VIGS載體在沉默目標(biāo)基因時(shí)植株不出現(xiàn)病毒癥狀；此外，還有基于煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus) 伴隨的衛(wèi)星DNAβ[67]和衛(wèi)星Alphasatellite(即DNA1)構(gòu)建的VIGS載體[68]，上述衛(wèi)星DNA用于VIGS具有不產(chǎn)生病毒癥狀、基因沉默效率高且穩(wěn)定持久、能夠抑制分生組織基因表達(dá)及遺傳操作容易等優(yōu)點(diǎn)，在本氏煙、番茄、普通煙草、矮牽牛等茄科植物上均得到了有效應(yīng)用。

VIGS載體是經(jīng)過(guò)基因工程技術(shù)改造后的病毒，因此每個(gè)VIGS載體只能有效引起一定范圍植物的基因沉默，構(gòu)建載體時(shí)病毒的選擇對(duì)能否高效誘導(dǎo)基因沉默至關(guān)重要，理想狀況是，選擇的病毒應(yīng)該沒(méi)有或產(chǎn)生很輕的病毒癥狀，不影響沉默表型的觀察，在插入外源DNA片段后能保持良好的侵染性，無(wú)沉默抑制子，沉默高效持久，可侵染包括分生組織的各種組織，可均勻擴(kuò)散積累于寄主植物各器官組織，具有廣寄主范圍等特點(diǎn)[9]。此外，在VIGS載體構(gòu)建時(shí)，外源插入片段的長(zhǎng)度范圍、特征、區(qū)域選擇及其與靶基因的同源性等都對(duì)沉默效率有很大的影響，應(yīng)根據(jù)所選病毒種類、沉默植物和組織類型、目標(biāo)靶基因以及研究目的進(jìn)行優(yōu)化?？傊?，要協(xié)調(diào)病毒在植物寄主體內(nèi)的復(fù)制傳播和植物生長(zhǎng)發(fā)育之間的動(dòng)態(tài)平衡，必須注意確定最優(yōu)接種方式和植物生長(zhǎng)環(huán)境條件[69]，保證沉默信號(hào)分子可在植物體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)性擴(kuò)散和擴(kuò)增放大[70]，確保系統(tǒng)性沉默的高效持久。

3 VIGS在茄科植物基因功能解析研究中的應(yīng)用

3.1 茄科植物生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)分子調(diào)控相關(guān)基因的功能研究

由于VIGS是一種不需要遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，目標(biāo)基因沉默后的表型和生理生化指標(biāo)變化在植株當(dāng)代短期內(nèi)即可觀察和測(cè)量，因此可便捷地鑒定果實(shí)發(fā)育、成熟和花器官發(fā)育等性狀相關(guān)調(diào)控基因的功能。MutSHomolog(MSH1)基因編碼蛋白質(zhì)定位于葉綠體和線粒體，主要功能是維持線粒體基因組穩(wěn)定性[71]。楊曉東[71]通過(guò)基于煙草脆裂病毒載體的VIGS體系，在本氏煙和番茄上實(shí)現(xiàn)了MSH1基因的沉默，證明MSH1基因可調(diào)控植物發(fā)育重編程。另外，發(fā)育相關(guān)基因的突變有可能使植株死亡，由于VIGS體系是一種瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，為分析發(fā)育相關(guān)的致死基因功能提供了一個(gè)有利的工具。Peele等[52]利用雙生病毒番茄金色花葉病毒的DNA A和DNA B為基礎(chǔ)構(gòu)建載體，在本氏煙中研究了在分生組織中高度表達(dá)的胚胎發(fā)育必需基因PCNA的功能，證明雙生病毒VIGS載體可在全植株實(shí)現(xiàn)分生組織功能相關(guān)基因的沉默。番茄果實(shí)發(fā)育成熟調(diào)控機(jī)制是茄科植物果實(shí)發(fā)育研究中最為深入的，孔俊花[72]采用PVX-VIGS體系，揭示了番茄中首個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟的表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子LeSPL-CNR的作用機(jī)制。另外，葉綠素降解代謝關(guān)鍵酶基因PAO和半胱氨酸蛋白酶基因CP是葉片衰老相關(guān)基因[73]，肖懷娟[73]利用TRV重組載體，揭示了辣椒CaCP基因和CaPAO基因在激素脫落酸(ABA)和非生物逆境脅迫下，具有正調(diào)控葉片衰老和葉片自然衰老進(jìn)程的功能。運(yùn)用VIGS技術(shù)，在茄科植物中一系列開(kāi)花相關(guān)和花器官發(fā)育相關(guān)基因的功能陸續(xù)被驗(yàn)證。吉姣姣[74]闡明了與辣椒保持系中線粒體正常atp6-2基因抑制線粒體ATPase水解活性相反，不育系中突變基因Ψatp6-2促進(jìn)了線粒體ATPase水解活性，導(dǎo)致辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育。曹凱[75]證明了番茄FT-like開(kāi)花相關(guān)基因SlSP5G為長(zhǎng)日照條件下的開(kāi)花抑制基因，而SlSP5G2和SlSP5G3基因在短日照條件下抑制番茄開(kāi)花。Dong等[76]利用構(gòu)建的免連接克隆載體TRV-LIC，在本氏煙中驗(yàn)證了調(diào)控花器官發(fā)育的番茄SlMADS1基因和其本氏煙中的同源基因NbMADS4-1和NbMADS4-2的功能，并且證明NbMADS4-1和NbMADS4-2的功能是非冗余的。另外，馬寧等[77]構(gòu)建了控制辣椒花發(fā)育基因PAP3的TRV-VIGS載體，為解析調(diào)控花瓣和雄蕊發(fā)育的同類辣椒基因功能提供了VIGS載體體系。

此外，在茄科植物品質(zhì)分子調(diào)控相關(guān)基因功能研究領(lǐng)域，Tian等[78]通過(guò)TRV-VIGS體系，以辣椒果實(shí)為植物材料，證明了辣椒紅素合成通路中的限速酶Ccs基因以及其他3個(gè)關(guān)鍵酶基因Psy、Lcyb、Crtz均與辣椒紅素合成有關(guān)，為改良辣椒品質(zhì)提供了基因資源。

3.2 茄科植物代謝產(chǎn)物生物合成途徑調(diào)控基因的功能鑒定

應(yīng)用VIGS技術(shù)，在茄科植物中，一系列初生代謝和次生代謝調(diào)控中的相關(guān)基因的功能得到驗(yàn)證。主要包括光合反應(yīng)過(guò)程中必需色素的合成代謝、酚類次生代謝物生物合成、萜烯類化合物代謝調(diào)控、生物堿生物合成途徑中的多種關(guān)鍵基因功能的解析。

八氫番茄紅素脫飽和酶(Phytoene desaturase, PDS)基因是類胡蘿卜素代謝途徑中的重要關(guān)鍵酶基因之一，在光合作用過(guò)程中，類胡蘿卜素具有防止光化學(xué)反應(yīng)中葉綠素的光氧化、保護(hù)葉綠素分子的作用。自Kumagai等1995第一次利用煙草花葉病毒在煙草中建立VIGS系統(tǒng)以來(lái)，PDS基因一直作為指示VIGS體系是否成功建立的報(bào)告基因，該基因mRNA的沉默降解會(huì)引起植物葉片、果實(shí)和花等器官出現(xiàn)變白或變黃的現(xiàn)象，目前已普遍在茄科的茄屬(Solanum)[79]、辣椒屬(Capsicum)[74]、番茄屬(Lycopersicon)[17,21]、煙草屬(Nicotiana)[5]、曼陀羅屬(Datura)[15]、枸杞屬(Lycium)[14]、酸漿屬(PhysalisL.)[80]、天仙子屬(HyoscyamusL.)[81]、顛茄屬(AtropaL.)[82]、碧冬茄屬(PetuniaJuss.)[17,83]植物中用于VIGS體系的建立與優(yōu)化研究。

在生物堿生物合成和代謝調(diào)控途徑相關(guān)基因的功能驗(yàn)證研究方面，Takizawa等[84]利用番茄花葉病毒載體在本氏煙中研究了腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)基因的功能，PMT基因是煙堿和托品烷類生物堿生物合成的關(guān)鍵調(diào)控酶基因，其主要在根中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，在本氏煙葉中接種重組VIGS載體體外轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)基因沉默后，不但抑制了根中PMT基因mRNA的積累水平，而且還降低了地上部葉中的煙堿積累含量。植物細(xì)胞色素P450酶是植物中參與生物堿、萜烯類、黃酮等多種次生代謝產(chǎn)物生物合成和代謝調(diào)控的一個(gè)蛋白質(zhì)家族。Li等[85]基于TRV-VIGS載體體系，證明了埃及天仙子(HyoscyamusmuticusL.)中的1個(gè)細(xì)胞色素P450基因(CYP80F1)的編碼產(chǎn)物具有催化海螺堿(Littorine)生成莨菪堿(Hyoscyamine)的功能。此外，Bedewitz等[82]和李笑等[81]采用TRV-VIGS技術(shù)分別在顛茄(AtropabelladonnaL.)和天仙子(HyoscyamusnigerL.)中誘導(dǎo)了Ab-ArAT4和HnArAT3基因的沉默，研究結(jié)果證明了這2個(gè)芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因分別參與了顛茄和天仙子中莨菪烷生物合成途徑的調(diào)控。

萜類次生代謝產(chǎn)物是數(shù)量最為豐富的植物代謝物質(zhì)之一，利用VIGS技術(shù)，鑒定了多種萜類代謝調(diào)控途徑中關(guān)鍵基因的功能。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)是植物中類胡蘿卜素、赤霉素、脫落酸和二萜的前體化合物，其在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)的催化下合成，GGPPS是萜類生物合成途徑上的關(guān)鍵合成酶，魏攀等[86]從普通煙草(Nicotianatabacum)中克隆到了1個(gè)NtGGPPSL新基因，經(jīng)序列比對(duì)分析其應(yīng)該為普通煙草GGPPS小亞基基因的類似基因，利用TRV-VIGS系統(tǒng)在本氏煙中證明該基因確實(shí)為葉綠素和類胡蘿卜素生物合成途徑中的參與基因。番茄紅素是一種典型的四萜類類胡蘿卜素，是類胡蘿卜素生產(chǎn)途徑上生物合成紫黃質(zhì)、葉黃素、玉米黃素、新黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素和脫落酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯等植物激素的重要代謝中間化合物。Fantini等[87]利用基于煙草脆裂病毒的VIGS載體系統(tǒng)在番茄果實(shí)中沉默了9個(gè)候選基因：八氫番茄紅素合成酶基因PSY1、PSY2、PSY3，2個(gè)脫飽和酶基因PDS和ZDS(ζ-胡蘿卜素脫飽和酶基因)，以及類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因ZISO(ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因)和原番茄紅素異構(gòu)酶基因CrtISO、CrtISO-Like1和CrtISO-Like2，并分析了不同代謝階段沉默果實(shí)中主要類胡蘿卜素異構(gòu)體的組成和含量變化，結(jié)果表明，PSY1、PDS/ZISO以及ZDS/CrtISO為番茄紅素生物合成途徑中的3個(gè)功能單元。辣椒紅素(Capasnthin)是辣椒果實(shí)中的主要紅色著色物質(zhì)，也是類胡蘿卜素代謝途徑在辣椒果實(shí)中的最終代謝化合物，其是由番茄紅素在番茄紅素β-環(huán)化酶(LCYB)作用下生成β-胡蘿卜素后，在多個(gè)酶的依次催化下合成的，其中辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶(CCS)是一個(gè)主要的關(guān)鍵酶[88]。田士林[89]采用TRV-VIGS系統(tǒng)單個(gè)或同時(shí)沉默了辣椒紅素生物合成途徑中的重要調(diào)控酶基因，包括Ccs基因、Psy基因(八氫番茄紅素合成酶基因)、Lcyb基因和Crtz基因(β-胡蘿卜素羥化酶基因)。結(jié)果表明，被沉默的辣椒果實(shí)與對(duì)照相比這些基因表達(dá)顯著受到抑制，同時(shí)β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)特別是辣椒紅素的含量與正常果實(shí)相比顯著降低，綠色果實(shí)不能正常變紅，從而闡明了抑制類胡蘿卜素代謝途徑中相關(guān)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，可以阻止辣椒果實(shí)變色的機(jī)制。另外，脫落酸、甾醇類物質(zhì)油菜素內(nèi)酯等植物激素也屬于萜類化合物的衍生物，參于調(diào)節(jié)植物的多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。ABA是β-胡蘿卜素生成玉米黃素后，在玉米黃素環(huán)氧酶(ZEP)、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)等酶催化下合成的萜類植物激素。孫宇飛[90]利用VIGS技術(shù)在番茄中分別驗(yàn)證了ABA合成途徑上的限速酶基因SlNCEDs和降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因SlCYP707As(ABA-8′-羥化酶基因)的功能，結(jié)果表明兩基因?qū)BA代謝途徑和果實(shí)成熟調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)均產(chǎn)生了影響，對(duì)番茄的成熟分別起到促進(jìn)和抑制作用。油菜素甾醇類(Brassinosteroids,BRs)植物激素包括油菜素內(nèi)酯(Brassinolide,BL)等多個(gè)種類，是植物的六大激素之一，具有增強(qiáng)植物抵抗生物與非生物逆境脅迫、調(diào)控植物根莖葉生長(zhǎng)和發(fā)育繁殖等生理作用[91]。Burger等[92]分離了普通煙草中的2個(gè)鈍葉醇-14α-脫甲基酶基因NtCYP51-1和NtCYP51-2，并利用PVX-VIGS體系在本氏煙中沉默了NtCYP51-1基因，結(jié)果沉默植株與對(duì)照相比，CYP51酶催化底物鈍葉醇的量顯著增多、植株生長(zhǎng)矮化，證明該基因參與煙草BRs生物合成途徑。

植物中另一類重要的次生代謝產(chǎn)物是酚類天然產(chǎn)物，主要包括類黃酮、簡(jiǎn)單酚酸、木質(zhì)素等物質(zhì)，在植物中酚類物質(zhì)執(zhí)行廣泛的生理作用，包括調(diào)節(jié)植物新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育、使植物器官呈現(xiàn)顏色、吸收紫外線、抗逆境脅迫等。目前VIGS技術(shù)在茄科植物中已經(jīng)用于酚類物質(zhì)，特別是類黃酮次生代謝物生物合成途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶基因功能的研究。劉和平[93]采用TRV-VIGS體系研究矮牽牛發(fā)現(xiàn)，PhACC1、PhACC2和PhAAE13 3個(gè)基因?qū)Π珷颗；ㄇ嗨氐纳锖铣善鸬疥P(guān)鍵的調(diào)控作用；陶小榮等[94]利用中國(guó)番茄黃化曲葉病毒的DNA-A與其衛(wèi)星DNA構(gòu)建VIGS載體并對(duì)其進(jìn)行了改良，在矮牽牛中成功證明了類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶——查爾酮合成酶(Chalcone synthase)基因CHS的功能。Pandey等[95]運(yùn)用煙草脆裂病毒在漸狹葉煙草(Nicotianaattenuata)中證明了轉(zhuǎn)錄因子基因MYB是蘆丁和綠原酸生物合成途徑上的關(guān)鍵調(diào)控基因。Hoffmann等[96]利用VIGS技術(shù)在本氏煙中驗(yàn)證了木質(zhì)素生物合成途徑中的一個(gè)重要調(diào)控酶基因HCT的生物學(xué)功能。通過(guò)TRV-VIGS體系，朱峰等[97]和蘆亮亮等[98]還分別在本氏煙和番茄中鑒定了水楊酸代謝調(diào)控和維生素E合成途徑中的相關(guān)重要基因的功能。

3.3 茄科植物防御真菌病害信號(hào)傳導(dǎo)路徑中抗性相關(guān)重要基因的功能解析

近幾年來(lái)，伴隨VIGS體系的越來(lái)越多樣化和愈加高效穩(wěn)定，VIGS技術(shù)在茄科植物應(yīng)答生物與非生物脅迫信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的功能鑒定方面也得到了有效應(yīng)用。其中包括植物-真菌互作、植物-細(xì)菌互作、抗病毒、抗線蟲(chóng)、抗植食性害蟲(chóng)以及耐熱、抗旱等逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)通路中的重要基因。以下主要對(duì)茄科植物與真菌病原菌互作研究領(lǐng)域相關(guān)重要基因的功能鑒定進(jìn)行小結(jié)。

目前，病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)已應(yīng)用于多種茄科植物抵御真菌病原物相關(guān)關(guān)鍵基因的挖掘研究，其中包括番茄抗白粉病、番茄抗葉霉病、茄子抗黃萎病、辣椒抗白粉病等。Ve基因家族的成員編碼類受體蛋白，介導(dǎo)多種茄科植物對(duì)黃萎病的抗性，劉軍等[99]從茄屬近緣種野生茄(Solanumlinnaeanum)的根部分離到了的一個(gè)Ve類基因的同源基因片段SlVe，通過(guò)構(gòu)建重組的TRV-SlVe載體，抑制了野生茄中SlVe基因的表達(dá)，使野生茄失去了對(duì)茄子黃萎病的高抗性。Mlo基因家族成員負(fù)調(diào)控植物對(duì)白粉病的抗性，Zheng等[100]采用同源克隆法從辣椒中分離到了一個(gè)Mlo類基因CaMlo2，并采用煙草脆裂病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，在辣椒中分別沉默了CaMlo2及其同源基因CaMlo1，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，沉默植株接種辣椒白粉病菌后，病原菌的菌落和生長(zhǎng)量均顯著減少，而且CaMlo2沉默植株的病原菌敏感性降低的更為顯著。Ol-1基因?yàn)橐吧?SolanumhabrochaitesG1.1560)中介導(dǎo)白粉病抗性的顯性抗病基因，Pei等[101]以抗病番茄G1.1560為植物材料，通過(guò)構(gòu)建免連接的TRV-LIC載體，沉默了受番茄白粉病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的多個(gè)候選基因序列，結(jié)果其中一個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶編碼基因ShGSTU1的沉默，導(dǎo)致了G1.1560沉默植株出現(xiàn)感病癥狀，推測(cè)ShGSTU1基因可能為Ol-1介導(dǎo)的抗性信號(hào)傳遞路徑中的重要基因。Mi-1基因存在于秘魯番茄(Solanumperuvianum)等番茄野生種中，為根結(jié)線蟲(chóng)、蚜蟲(chóng)和粉虱的抗性基因，Ol-4和Ol-6基因與Mi-1均定位于番茄第6號(hào)染色體短臂上的同一抗病基因簇中，Ol-4和Ol-6基因介導(dǎo)對(duì)番茄白粉病的抗性，Seifi等[102]以對(duì)白粉病、線蟲(chóng)和蚜蟲(chóng)均具有抗性的番茄近等基因系NIL-Ol-4(含有Ol-4基因)和NIL-Ol-6(含有Ol-6基因)為研究材料，利用TRV-VIGS技術(shù)揭示了Ol-4和Ol-6基因是Mi-1基因的同源基因，2個(gè)近等基因系對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)和番茄白粉病菌的抗性受同源連鎖(如果不是同一個(gè))的Mi-1同源基因的控制。在植物與病原真菌互作系統(tǒng)中，番茄與葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)的非親和互作符合基因?qū)蚣僬f(shuō)，寄主抗病基因(cf)與病原菌無(wú)毒基因(Avr)的編碼產(chǎn)物相互作用后誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)敏性壞死(Hypersensitive response,HR)等一系列抗病反應(yīng)，抵御病原菌的侵染，造成病原菌最終死亡[103]。目前運(yùn)用VIGS技術(shù)研究的番茄抗葉霉病相關(guān)基因主要集中于cf9/Avr9、cf4/Avr4介導(dǎo)的抗病反應(yīng)調(diào)控通路[104-105]。如徐秋芳[106]采用基因型cf-4(HR-)對(duì)比Avr4/Cf-4(HR+)、基因型cf-9(HR-)對(duì)比Avr9/Cf-9(HR+)，利用雙向電泳技術(shù)和cDNA-AFLP技術(shù)分別獲得了cf9/Avr9和cf4/Avr4誘導(dǎo)番茄過(guò)敏性反應(yīng)過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和ACE(Acr/cfelicited)基因片段，并采用TRV介導(dǎo)的基因沉默方法，揭示其中天冬酰胺合成酶、鈣離子結(jié)合蛋白等15個(gè)基因參與了cf9/Avr9和cf4/Avr4誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)。趙婷婷[107]針對(duì)cf-4等番茄抗病基因失去了對(duì)一些葉霉病菌生理小種抗性的育種現(xiàn)狀，探索研究了抗病基因cf-19的抗病功能，通過(guò)重測(cè)序、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)以及cDNA-AFLP等方法，定位cf-19基因于番茄1號(hào)染色體的短臂，篩選得到了cf-19的2個(gè)候選基因以及cf-19介導(dǎo)的抗性信號(hào)傳遞過(guò)程中的相關(guān)基因，并以煙草脆裂病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建了這些基因的VIGS載體，優(yōu)化了TRV-VIGS侵染系統(tǒng)，為深入研究cf-19基因激發(fā)的抗病性反應(yīng)的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

4 VIGS技術(shù)在茄科植物基因功能研究中存在的問(wèn)題和前景展望

與其他反向遺傳學(xué)方法相比，由于病毒誘導(dǎo)基因沉默具有效率高、試驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)易及高通量特點(diǎn)等顯著優(yōu)勢(shì)，其已成為茄科植物多個(gè)研究領(lǐng)域特別是抗病反應(yīng)信號(hào)傳遞過(guò)程中基因功能驗(yàn)證或鑒定的重要方法之一，但該技術(shù)體系在茄科植物上應(yīng)用還有一些局限性，需要加以改進(jìn)。

建立高效VIGS體系的關(guān)鍵點(diǎn)之一是選擇和構(gòu)建適合寄主植物的、可以有效沉默目的基因的VIGS載體，當(dāng)前在茄科植物中應(yīng)用的VIGS載體主要包含RNA病毒載體、RNA病毒的衛(wèi)星病毒載體、DNA病毒載體、衛(wèi)星DNA載體等4種，一般能引起寄主發(fā)生高效基因沉默的VIGS載體均具有植物對(duì)其敏感、病癥輕或無(wú)、沉默信號(hào)分子在宿主體內(nèi)能進(jìn)行系統(tǒng)性擴(kuò)散和擴(kuò)增放大等特點(diǎn)，目前成功運(yùn)用VIGS技術(shù)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證或鑒定的茄科植物主要包括普通番茄、本氏煙、普通煙草、矮牽牛等草本茄科植物，但對(duì)于枸杞屬等灌木類茄科植物，由于生長(zhǎng)童期長(zhǎng)、病毒寄主范圍的局限性，VIGS技術(shù)的應(yīng)用還有一定的限制，只有Liu等[14]通過(guò)建立TRV-VIGS沉默體系，在寧夏枸杞和黑果枸杞的種子幼苗和種芽中顯著抑制了PDS基因和鎂離子螯合酶的H亞基(ChlH)基因的表達(dá)，但未能在枸杞果實(shí)中建立TRV誘導(dǎo)的沉默體系，今后需要選擇和開(kāi)發(fā)容易感染枸杞等木本茄科植物，而且易于在木質(zhì)部生長(zhǎng)、增殖、傳播且病毒癥狀輕的病毒載體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)木本茄科植物發(fā)育調(diào)控、生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及果實(shí)等性狀相關(guān)基因的功能驗(yàn)證和鑒定。

宿主誘導(dǎo)的基因沉默(Host induced gene silencing, HIGS)也是一種PTGS現(xiàn)象，是VIGS技術(shù)的拓展應(yīng)用，其是以植食性害蟲(chóng)或病原菌致病或生長(zhǎng)繁殖發(fā)育相關(guān)的重要基因?yàn)槌聊袠?biāo)，通過(guò)在寄主植物中表達(dá)重組的HIGS載體(其中包括VIGS載體)，使害蟲(chóng)或病原物在危害植物時(shí)靶標(biāo)基因的表達(dá)受到抑制，限制病蟲(chóng)對(duì)宿主的危害，使植物獲得抗病蟲(chóng)能力[108]。目前，主要在單子葉植物和棉花與病原菌互作研究上應(yīng)用較多，比如小麥-小麥白粉病菌(B.graminisf. sp.tritici)[109]、棉花-黃萎病菌(VerticilliumdahliaKleb.)[110]、小麥-小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)[111]、小麥-小麥葉銹病菌(Pucciniatriticina)[112]等互作系統(tǒng)，但在茄科植物抗病蟲(chóng)研究方面應(yīng)用極少，隨著越來(lái)越多昆蟲(chóng)和病原菌基因組測(cè)序工作的完成，在茄科植物中探索建立成熟高效的HIGS體系，不但對(duì)茄科植物害蟲(chóng)和病原菌的功能基因組解析和致病機(jī)制闡明具有重要推進(jìn)作用，而且針對(duì)一些茄科植物病蟲(chóng)害抗源缺乏、抗病性易喪失的特點(diǎn)，HIGS技術(shù)為其創(chuàng)制抗病蟲(chóng)育種材料提供了一條新路徑。