氟唑環(huán)菌胺原藥高效液相色譜分析方法研究

董文凱，韓金濤，王勝翔，柴洪偉，解銀萍，張 強(qiáng)，李旭坤

(1.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東省化學(xué)農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

1 前言

氟唑環(huán)菌胺ISO通用名：sedaxane，CAS號(hào)：874967-67-6，分子式：C18H19F2N3O，化學(xué)名稱(chēng)：N-[2-[1,1’-聯(lián)環(huán)丙基]-2-基苯基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺，結(jié)構(gòu)分為順式和反式結(jié)構(gòu)，以反式結(jié)構(gòu)為主[1-3]。氟唑環(huán)菌胺是一種琥珀酸脫氫酶抑制劑類(lèi)殺菌劑。通過(guò)抑制病原菌線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞鏈上的蛋白復(fù)合體Ⅱ(即琥珀酸脫氫酶)來(lái)影響病原菌線(xiàn)粒體呼吸電子傳遞系統(tǒng)，阻礙其能量的代謝，抑制病原菌的生長(zhǎng)并致其死亡。適用于谷物、大豆、油菜、玉米、馬鈴薯、甘蔗和果蔬作物，用作種子處理，防治黑粉病、絲黑穗病、黑星病、灰霉病等病害[2]。目前已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)登記使用，商品名為Vibrance。

氟唑環(huán)菌胺可用氣相色譜法進(jìn)行分析檢測(cè)[4]。本文采用高效液相色譜法，用外標(biāo)法對(duì)有效成分進(jìn)行定性定量分析。該方法操作快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到定量分析的要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 乙腈(色譜純)；磷酸(分析純)；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm，25℃)；氟唑環(huán)菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%)，由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所提供。氟唑環(huán)菌胺原藥由某公司提供。

2.2 試驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1200，具有二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；Millipore超純水制備系統(tǒng)；色譜柱：250mm×4.6mm(id)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C185μm填充物；微孔濾膜：0.45 μm有機(jī)膜。

2.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：ψ(乙腈:0.1%磷酸溶液)=65:35；流量：1.5mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：氟唑環(huán)菌胺約4.2min(反式)和4.7min(順式)(圖1)。

圖1 氟唑環(huán)菌胺原藥高效液相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取氟唑環(huán)菌胺標(biāo)樣0.03 g(精確至0.000 2 g)置于100 mL容量瓶中，先加5 mL水再用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

2.4.2 線(xiàn)性試驗(yàn)系列溶液配制 在2.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的條件下，稱(chēng)取不同量的標(biāo)準(zhǔn)品，配置成一系列校正曲線(xiàn)溶液，使氟唑環(huán)菌胺的質(zhì)量濃度分別為0.121 1、0.181 4、0.302 3、0.483 7、0.604 6 g/L用于制作校正曲線(xiàn)。

2.4.3 試樣溶液的配制 稱(chēng)取試樣0.03g(精確至0.000 2 g)，置于100 mL容量瓶中，先加5 mL水再用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

2.4.4 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器基線(xiàn)穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液的響應(yīng)值相對(duì)變化<1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.5 計(jì)算 將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中氟唑環(huán)菌胺峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中氟唑環(huán)菌胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按式(1)計(jì)算：

式中：

A1──標(biāo)樣溶液中氟唑環(huán)菌胺峰面積的平均值；

A2──試樣溶液中氟唑環(huán)菌胺峰面積的平均值；

m1──標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2──試樣的質(zhì)量，g；

P──標(biāo)樣中氟唑環(huán)菌胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇 使用Agilent 1200高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，獲得氟唑環(huán)菌胺的紫外吸收譜圖(圖2)。從圖中可見(jiàn)氟唑環(huán)菌胺在190～220nm處有較大的吸收，為避免溶劑干擾，且氟唑環(huán)菌胺有較強(qiáng)吸收峰，選擇220nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 氟唑環(huán)菌胺紫外吸收譜圖

色譜柱選擇常規(guī)的ZORBAX SB-C18反相柱。依據(jù)氟唑環(huán)菌胺物化性質(zhì)，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，為了得到更好的分離效果和峰形，在1 000 mL水中加入1 mL磷酸，將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定流動(dòng)相為ψ(乙腈:磷酸溶液)=65:35，在流速1.5mL/min時(shí)，有效成分與雜質(zhì)能得到很好的分離，峰形對(duì)稱(chēng)，基線(xiàn)平穩(wěn)，能在短時(shí)間能得到滿(mǎn)意的分析結(jié)果，提高了工作效率。

3.2 方法的線(xiàn)性相關(guān)性試驗(yàn) 在2.3的色譜條件下，將2.4.2中系列線(xiàn)性試驗(yàn)溶液依次注入5 μL，以氟唑環(huán)菌胺的質(zhì)量濃度(x，g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(y, mAU)為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線(xiàn)。試驗(yàn)測(cè)得氟唑環(huán)菌胺線(xiàn)性方程為y=12 058.86x+10.46，相關(guān)系數(shù)為1.000 0。結(jié)果表明氟唑環(huán)菌胺在測(cè)試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.3 方法的精密度試驗(yàn) 從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱(chēng)取5個(gè)試樣，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，計(jì)算氟唑環(huán)菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。氟唑環(huán)菌胺標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，變異系數(shù)為0.06%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氟唑環(huán)菌胺(98.51%)中稱(chēng)取5個(gè)試樣，分別加入一定量的氟唑環(huán)菌胺標(biāo)樣(99.5%)，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得氟唑環(huán)菌胺的平均回收率為100.08%(表2)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本方法建立的分離并檢測(cè)氟唑環(huán)菌胺原藥中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜分析方法，線(xiàn)性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度較高，具有快速、簡(jiǎn)便、分離效果好，精密度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，適用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。