辛伐他汀與明膠海綿對兔肩袖修復術后腱-骨愈合的影響

李肯 戚超 趙夏 于騰波

作者單位：266003 山東，青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院運動醫(yī)學科

肩袖肌腱損傷 ( rotator cuff tears，RCT ) 是造成肩關節(jié)疼痛及功能障礙最常見的疾病之一，其中岡上肌腱損傷最為多見[1]，約占肩袖損傷的 35%～38%。肩袖肌腱損傷往往須手術治療，而手術成功的關鍵很大程度上取決于術后肩袖止點的腱-骨愈合情況，據(jù)統(tǒng)計，肩袖肌腱修復的失敗率為20%～90%[2]，肩袖止點腱-骨愈合不良不但延長了治療時間，而且還會影響患者術后肩關節(jié)的功能康復[3]。長期以來如何更好地促進肩袖腱-骨愈合，使其恢復原有的功能，一直是運動醫(yī)學科醫(yī)生的追求。辛伐他汀為臨床上常用藥，能夠降低血清膽固醇水平及心臟病的發(fā)作，常用來治療高脂血癥[4-5]。有研究證明局部應用辛伐他汀能夠促進前交叉韌帶重建骨隧道腱-骨愈合的作用[6]，但其對于肩袖修復術后腱-骨愈合的作用，目前研究較少。本實驗通過建立兔肩袖損傷模型來研究局部應用辛伐他汀對肩袖修復術后腱-骨愈合的影響。

材料與方法

一、材料和實驗對象

辛伐他汀 ( 杭州默沙東制藥有限公司 )、明膠海綿 ( 南京金陵制藥廠 )、Instron-3300 萬能材料試驗機 ( 青島大學提供 )、24 只體重 2.0～3.0 kg 的成年雄性新西蘭大白兔 ( 青島大學動物實驗中心提供 )。

二、辛伐他汀 / 明膠海綿復合物的制備

將 5 mg 辛伐他汀粉末溶于 10 ml 無水乙醇中混合均勻，然后吸取 1 ml 該溶液浸入明膠海綿 ( 10 mm長，5 mm 寬，2 mm 高 ) 中，使每塊明膠海綿含有0.5 mg 的辛伐他汀，自然干燥消毒后置于 4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 a：一片約 0.8 cm × 0.5 cm 的岡上肌( SSPT )；b：將辛伐他汀 / 明膠海綿復合物( SGS ) 填塞到大結節(jié)骨槽 ( Bone trough ) 上并用5-0 Prolene 縫線穿過骨孔 ( Bone tunnels ) 以水平褥式縫合法縫合Fig.1 a: A slice of supraspinatus ( SSPT ): 0.8 cm ×0.5 cm approximately; b: The complex of simvastatin /gelatin sponge ( SGS ) was stuffed into the bone trough the large tuberosity of the humerus and the supraspinatus was sutured through the bone tunnels with 5-0 Prolene nesis by horizontal mattress suture

三、 兔肩袖損傷模型的建立

取所有兔的右肩關節(jié)作為手術側，用 3% 的戊巴比妥鈉 ( 1ml / kg ) 行耳緣靜脈緩慢推注，麻醉成功后固定于動物手術臺，常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌巾。沿兔肩胛岡遠端 2 cm 作縱行切口，鈍性分離三角肌并暴露兔崗上肌，于大結節(jié)止點銳性切斷岡上肌腱，用刀片沿肱骨大結節(jié)至岡上肌近端方向剝離約 0.8 cm×0.5 cm 的岡上肌區(qū)域建立兔全層肩袖損傷模型，剝離下的岡上肌 ( 圖 1a )。岡上肌游離端用縫線標記以便二次手術準確定位。術后常規(guī)飲食，慶大霉素 ( 3 mg / kg ) 右后腿肌注預防感染，持續(xù)3 天，術后單籠限制性飼養(yǎng)，無須制動固定。

四、實驗分組及實驗過程

24 只造模后的兔子隨機分為實驗組 ( n＝12 ) 和對照組 ( n＝12 )。實驗組即辛伐他汀 / 明膠海綿復合物組，造模后 1 周將右側大結節(jié)上殘留的纖維軟骨完全剔除，牙科磨鉆將岡上肌腱-骨結合部分打磨一骨槽 ( 10 mm 長，5 mm 寬，2 mm 深 )，用直徑為0.8 mm 的克氏針自骨槽內側向大結節(jié)外側皮質鉆兩個交叉的骨孔，將辛伐他汀 / 明膠海綿復合物填塞入骨槽內，5-0 Prolene 不可吸收縫線以水平褥式縫合法穿過骨孔將岡上肌肌腱斷端拉回骨槽，并在肱骨大結節(jié)外側皮質打結固定 ( 圖 1b )。對照組僅填塞入明膠海綿，其余處理同前述。

五、檢測方法

1. 大體觀察：觀察有無傷口感染、免疫反應以及 BTJ 愈合情況等。

2. 生物力學測試：兩組于術后 2、4、8 周各處死 4 只兔子，以岡上肌止點為中心，截取整個岡上肌及近端肱骨，將標本固定在美國 Instron-3300 萬能材料試驗機上進行拉斷測試，載荷率為 5 mm /min，測量最大抗拉強度及剛度 ( 圖 2 )。

3. HE 染色觀察：將生物力學測試完的標本置于10% 甲醇溶液中固定后 24 h 行甲酸脫鈣，脫鈣完全后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最終以5 μm 厚度切片行 HE 染色。

六、統(tǒng)計學處理

用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間均值比較采用獨立樣本t 檢驗，組內比較采用單因素方差分析。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、大體觀察所見

所有兔子術后均存活，切口愈合良好，未見滲液、感染及辛伐他汀不良反應。實驗組 BTJ 愈合可，可見輕度炎癥反應；對照組肩關節(jié)積液較多，瘢痕粘連較重，部分 BTJ 呈腱-骨分離狀態(tài)。

二、生物力學檢測

實驗組的最大抗拉強度和剛度在 2、4、8 周逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )；實驗組2 周最大抗拉強度和剛度與對照組差異無統(tǒng)計學意義( P＞0.05 )；實驗組術后 4、8 周的最大抗拉強度和剛度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 )。提示實驗組的力學性能高于對照組 ( 表 1，2 )。

表1 術后各時間點最大抗拉強度 ( N )Tab.1 Results of maximum tensile strength at different time points after surgery ( N )

表2 術后各時間點剛度 ( N / mm )Tab.2 Results of stiffness at different time points after surgery ( N /mm )

三、HE 染色

實驗組 2 周腱-骨界面可見大量新生毛細血管和較多成纖維細胞增生，并夾雜大量炎性細胞浸潤 ( 圖 2 )。對照組 2 周肌腱與骨結合松散，中間有疏松結締組織，可見梭形成纖維細胞增生，炎性細胞數(shù)量較實驗組少 ( 圖 3 )。實驗組 4 周炎性細胞數(shù)量顯著減少，可見較多新生毛細血管和軟骨細胞增生 ( 圖 4 )。對照組 4 周肌腱與骨結合較 2 周時致密，梭形成纖維細胞遍布視野，未見軟骨細胞( 圖 5 )。實驗組 8 周腱-骨界面已出現(xiàn)典型的四層移行帶結構，層次清楚，可見“潮線”以及密集的Sharpey 纖維 ( 圖 6 )。對照組 8 周肌腱與骨連接較為致密，腱-骨界面可見疏松無序的 Sharpey 纖維( 圖 7 )。

圖2 實驗組 2 周 ( HE × 100 ) Fig.2 2 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖3 對照組 2 周 ( HE × 100 ) Fig.3 2 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

圖4 實驗組 4 周 ( HE × 100 ) Fig.4 4 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖5 對照組 4 周 ( HE × 100 ) Fig.5 4 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

圖6 實驗組 8 周 ( HE × 100 ) Fig.6 8 weeks postoperatively in the experimental group ( HE × 100 )

圖7 對照組 8 周 ( HE × 100 ) Fig.7 8 weeks postoperatively in the control group ( HE × 100 )

討 論

肩袖對維持肩關節(jié)的穩(wěn)定和活動起著十分重要的作用。肩袖損傷后由于肌腱攣縮粘連、脂肪浸潤以及術后腱-骨愈合不良等原因常導致再次撕裂。正常的肩袖止點愈合又稱為直接愈合，是較為理想的腱-骨愈合方式，即腱-骨界面依次由肌腱，未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組織形成牢固的直接止點。而肩袖修復術后肌腱與骨多以纖維瘢痕組織粘連，難以形成直接止點結構，穩(wěn)固性大大降低。因此，如何促進肩袖止點的直接愈合成為運動醫(yī)學科醫(yī)生研究的熱點。

目前促進腱-骨愈合的方法有很多，其中包括間充質干細胞、沖擊波、骨膜移植、富血小板血漿[7-8]。辛伐他汀屬于 HMG-CoA 還原酶抑制劑，是臨床上常用的降脂藥物。有研究表明辛伐他汀能夠增強血管內皮生長因子 mRNA 和蛋白質的表達，來促進血管和骨的生成從而刺激骨折愈合[9-10]。同樣，辛伐他汀對腱-骨愈合的積極作用也與血管生成和骨形成增加有關。在實驗組 2 周，腱-骨界面可見大量新生毛細血管生成，證明辛伐他汀能夠增強腱-骨界面的血管再生，從而促進腱-骨愈合。而且在腱-骨愈合中，新生血管的生成比骨的生成意義更大，因為新生血管的生成意味著腱-骨界面的骨再生[11]。在實驗組 2 周，腱-骨界面可見大量炎性細胞浸潤，是由于腱-骨愈合的早期需經(jīng)歷炎癥機化，而辛伐他汀對炎癥因子具有調節(jié)作用，它可以使炎性細胞在趨化因子的作用下向腱-骨界面遷移從而引發(fā)炎癥反應，各種炎性細胞可以釋放大量生長因子來促進腱-骨愈合。另外，辛伐他汀也可促進軟骨細胞和成纖維細胞的生成。在實驗組4 周，腱-骨界面可見大量軟骨細胞和成纖維細胞增生，纖維軟骨移行帶逐漸形成，但以未礦化的纖維軟骨為主，未見明顯的“潮線”結構以及 Sharpey纖維，表明腱-骨界面正逐漸形成直接止點。實驗組四周炎癥細胞數(shù)量顯著減少，表明腱-骨愈合進程由炎癥機化期進入到軟骨修復期。到實驗組8 周，腱-骨界面已大致出現(xiàn)典型的四層結構，其間可見“潮線”結構以及 Sharpey 纖維。而對照組在各時間點腱-骨界面結合松散，新生毛細血管、炎性細胞及軟骨細胞明顯少于實驗組，腱-骨愈合緩慢。在生物力學方面，實驗組 2 周最大抗拉強度及剛度與對照組差異無統(tǒng)計學意義，這是由于腱-骨界面在最初 14 天主要以纖維組織瘢痕增生為主，彈性差，脆性高，未形成牢固的纖維軟骨帶，因此在此時期患者容易發(fā)生再次撕裂。有研究表明，腱-骨愈合部位轉化生長因子-β1 ( TGF-β1 ) 的表達在 10 天左右達到高峰并一直持續(xù)到術后 3～4 周[12]。筆者猜測，腱-骨界面的瘢痕增生主要與 TGF-β1 的表達增加有關。而到術后第 4 周及第8 周，實驗組的最大抗拉強度及剛度均明顯高于對照組 ( P＜0.05 )，表明此時腱-骨界面的愈合方式已由瘢痕增生逐漸轉變?yōu)橹苯佑希w維軟骨以及新生骨小梁逐漸向腱-骨界面內長入，腱-骨界面的抗拉強度及剛度明顯增加。證明辛伐他汀能夠促進腱-骨界面的直接止點的形成，增強其生物力學強度，促進腱-骨愈合。

由于辛伐他汀不能很好地吸收，口服給藥須經(jīng)肝臟的首過消除，到達體循環(huán)的不足 5%，生物利用率低[13]。超大劑量的全身應用辛伐他汀會增加肝衰竭，腎臟疾病，橫紋肌溶解，肌痛等風險[14]。本研究采用了以明膠海綿作為載體，將辛伐他汀緩慢持久的遞送到局部組織，避免了藥效的流失。明膠海綿具有無毒性、可降解性、良好的三維結構、生物相容性以及生物安全性，是較為理想的載體材料。臨床上常用來作為可吸收填塞物[15]。辛伐他汀已被證明具有局部和全身抗炎特性，但是不同于全身給藥，局部高劑量輸送辛伐他汀會影響細胞和組織，并引起嚴重的炎癥反應。因此，選擇合適的局部用藥劑量十分重要。Wong 等[16]用含有 0.5 mg 辛伐他汀應用于兔骨缺損模型，骨修復效果顯著。也有動物實驗證實[17]，1 mg 辛伐他汀和硫酸鈣的組合治療大鼠顱蓋骨缺損，成骨作用明顯。Stein 等[18]在大鼠下頜骨骨膜上局部施用不同劑量的辛伐他汀( 0.1，0.5，1.0 和 2.2 mg ) 來促進骨骼生長。這項研究證明，0.1 mg 的用藥劑量與另外三種相比，雖然不會明顯引起軟組織炎癥，但也不能顯著刺激骨生長。當辛伐他汀劑量從 2.2 mg 減少到 0.5 mg 時，炎癥不但可以降低至臨床上更為接受的水平，而且不會犧牲骨的生長潛力。同樣有研究證明[19]，局部應用 0.5 mg 辛伐他汀可以明顯減少臨床炎癥并保持顯著的骨生長。因此，本實驗選用 0.5 mg 的辛伐他汀作為注射劑量，達到了促進腱-骨愈合的效果。

本次實驗將明膠海綿作為載體，將辛伐他汀局部應用到建立的兔肩袖損傷模型中，材料安全且價格便宜，具有促進肩袖損傷修復術后腱-骨愈合的作用。但是本實驗樣本量較少且辛伐他汀劑量單一，在未來的研究中，應該在大量動物實驗基礎上進行劑量遞增研究。