鹽芥EsABCG25的克隆及其表達(dá)分析

松布爾巴圖 陳悅 陳寧美 唐帥 徐小靜

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters），是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一，廣泛存在于植物細(xì)胞的質(zhì)膜、液泡、線粒體和過(guò)氧化物酶體中，在植物生理活動(dòng)中發(fā)揮各自作用［1-2］。植物中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣。它們參與植物體內(nèi)激素、脂質(zhì)、金屬離子、次生代謝物和外源物質(zhì)的運(yùn)輸，且與植物抵抗病原體和逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主要特征就是含有一個(gè)ATP結(jié)合盒的結(jié)構(gòu)［3］，成員通常含有1-2個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding domains，NBDs）和1-2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domains，TMDs）。TMD通常含有4-6個(gè)跨膜的α螺旋，NBD結(jié)構(gòu)域則是一個(gè)長(zhǎng)度約200個(gè)氨基酸的保守區(qū)域［4］。ABC蛋白通過(guò)NBD的結(jié)構(gòu)特征和成員間的多基因親緣關(guān)系來(lái)分類［5-6］。ABCG蛋白是植物中最大的ABC蛋白亞家族［7］。擬南芥全基因組測(cè)序結(jié)果顯示其包含131個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其中ABCG是數(shù)量最多的亞族（44個(gè)）［8］。ABCG亞家族分為兩類。一類是WBC（White-brown complex）型，稱為半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。另一類為PDR（Pleiotropic drug resistance）型，稱為全分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［9］。目前，對(duì)植物ABCG蛋白的分布和功能開(kāi)展了廣泛研究。如擬南芥AtABCG11能運(yùn)輸角質(zhì)和蠟質(zhì)單體，對(duì)表皮形成有極重要的作用［10-12］；小立碗蘚中PpABCG7突變會(huì)使表皮蠟質(zhì)積累出現(xiàn)缺陷，降低小立碗蘚對(duì)干旱脅迫的抵抗能力［13］；水稻ABCG15對(duì)于花藥分裂和花粉發(fā)育是必需的［14］；百脈根 LjABCG1參與植株抗病性［15］；苜蓿MtABCG10可能參與植物抗毒素合成相關(guān)的類黃酮水平調(diào)節(jié)［16］。ABCG家族成員在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑中也發(fā)揮了作用［17-18］。2010年，Kuromori等［19］發(fā)現(xiàn)AtABCG25是植物激素脫落酸（ABA）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它以同源二聚體的形式，參與細(xì)胞間ABA信號(hào)通路，對(duì)葉表面的氣孔產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。過(guò)表達(dá)該基因后，保衛(wèi)細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的ABA信號(hào)以及水分的高效利用，從而增加擬南芥的抗旱性［20］。此外，部分植物的ABCG25的cDNA序列及其演繹的氨基酸序列已經(jīng)登錄至GenBank，為研究其功能提供了基礎(chǔ)。

鹽芥（E. salsugineum）是十字花科鹽芥屬植物。作為模式植物擬南芥的近緣物種，鹽芥具備生活周期短、自花授粉、基因組小、易誘變轉(zhuǎn)化等和擬南芥相似的特征［21］。研究表明，鹽芥具有對(duì)包括干旱、高鹽、異常溫度等多種逆境的更強(qiáng)的耐受性［22-26］。鹽芥全基因組序列的解析，為進(jìn)一步從分子遺傳水平探究鹽芥抗逆性奠定了基礎(chǔ)［27］。這使鹽芥在逆境響應(yīng)與耐受的分子機(jī)制研究方面更具價(jià)值。但目前對(duì)于鹽芥ABCG家族成員及其基因的結(jié)構(gòu)、分布和功能還所知甚少。為了探索鹽芥ABCG25的結(jié)構(gòu)特征及其在鹽芥抗逆性機(jī)制中的作用，本研究以已報(bào)道的鹽芥EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列為模板設(shè)計(jì)引物，通過(guò)電子克隆技術(shù)獲得EsABCG25的cDNA全長(zhǎng)序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)EsABCG25的組織特異性和脅迫響應(yīng)表達(dá)進(jìn)行探究，旨在為進(jìn)一步闡明EsABCG25的功能及其與鹽芥逆境響應(yīng)機(jī)制之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽芥材料生態(tài)型為山東型，其種子為實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體為pGEM-T easy（Promeaga公司）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取鹽芥組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、T4 DNA連接酶和DNaseI等試劑均購(gòu)自Promeaga公司。質(zhì)粒提取和凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM試劑購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽芥材料的準(zhǔn)備 鹽芥種子依次用75%乙醇消毒1 min和1%次氯酸鈉消毒10 min，用滅菌水沖洗5次，每次2 min。之后將種子均勻鋪于MS平板中，于4℃黑暗條件下春化一周。春化結(jié)束后置于光暗周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度100 μE/m2/s，溫度22℃的環(huán)境條件下培養(yǎng)。2周后將幼苗移栽入蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)，期間用營(yíng)養(yǎng)液澆灌。培養(yǎng)4周后，取長(zhǎng)勢(shì)相近的植株，分別進(jìn)行脅迫處理。NaCl處理：用含有200 mmol/L NaCl的營(yíng)養(yǎng)液澆灌。干旱處理：停止?jié)补酄I(yíng)養(yǎng)液至蛭石基質(zhì)完全失水。低溫處理：將鹽芥植株置于培養(yǎng)箱中4℃培養(yǎng)，正常澆灌營(yíng)養(yǎng)液。ABA處理：葉面噴灑50 μmol/L的ABA溶液。在NaCl、低溫和ABA處理12 h、24 h、1周時(shí)取中等大小葉片；干旱脅迫1-2周待葉片出現(xiàn)明顯萎蔫后復(fù)水12 h，取鹽芥葉片。采集的葉片經(jīng)液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鋈〔臅r(shí)均以未處理的鹽芥葉片作為對(duì)照。此外，正常條件下生長(zhǎng)的鹽芥植株，待其開(kāi)花結(jié)果之后，分別取根、蓮座葉、莖生葉、莖、花和角果等組織，液氮冷凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 用Trizol試劑提取鹽芥各組織的總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，通過(guò)檢測(cè)后，以O(shè)ligo dT（16）為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為25 μL，包括DEPC-ddH2O 13 μL、Rasin 1 μL、RNA 模 板 2 μL 和 Oligo dT（16）（10 μmol/L）1 μL?；靹蚝?，70℃預(yù)變性 10 min，置于冰上冷卻。之后依次加入5×MLV buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）2 μL 和 M-MLV 1 μL，混勻后42℃反應(yīng)9 min合成cDNA。完畢后，80℃變性5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 EsABCG25的電子克隆 以擬南芥AtABCG25序列（At1G71960）為參照對(duì)鹽芥的ESTs進(jìn)行Blastn比對(duì)。利用在線序列拼接程序CAP3對(duì)搜索到的與AtABCG25相似性較高的鹽芥EST序列進(jìn)行拼接。獲得序列重疊群后，再以之為種子重復(fù)上一步直至序列不能延伸為止。根據(jù)最終獲得的核酸序列設(shè)計(jì)上游和下游引物（EsABCG25P1：5'-CTCTCGTTCATTCTCTCAG-3'和EsABCG25P2：5'-GCTTAAATATTCCGAATTAA-3'）。 以 cDNA 為 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為25 μL，包含1×Taq酶buffer、0.25 mmol/L dNTP、上游和下游引物（0.4 μmol/L）、PfuDNA聚合酶1 μL以及cDNA模板。首先加入除DNA聚合酶外的其他組分，混勻后94℃預(yù)變性3 min，加入聚合酶進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后與pGEM-T easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。通過(guò)藍(lán)白斑篩選鑒定陽(yáng)性克隆，送樣至上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 EsABCG25及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 EsABCG25的染色體定位通過(guò)使用Bioedit軟件進(jìn)行該基因序列與鹽芥7條染色體DNA序列的BLASTN的結(jié)果來(lái)確定，位置圖使用MapInspect軟 件（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）繪制。使用Gene Structure Display Serve 2.0［28］（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）對(duì)基因內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用DNAMAN5.0軟件對(duì)EsABCG25編碼氨基酸序列進(jìn)行演繹并分析其氨基酸組成。利用ProtScale工具（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的分子量、疏水性、極性變化以及預(yù)測(cè)等電點(diǎn)［29］。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別通過(guò)SOPMA服務(wù)器（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行［30-31］。對(duì)于該基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析，首先通過(guò)NCBI Protein Blast工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索EsABCG25編碼氨基酸序列的同源序列，再將獲得的同源序列及EsABCG25氨基酸序列通過(guò)GeneDoc軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA5.2軟件根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 高通量測(cè)序分析EsABCG25的組織特異性表達(dá)與可變剪接事件 利用實(shí)驗(yàn)室的鹽芥六種組織的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)（由深圳華大基因科技有限公司構(gòu)建，項(xiàng)目編號(hào)F16FTSNCKF1028_THEiotE），根據(jù)已知的序列信息和GenBank登錄號(hào)比對(duì)至文庫(kù)中以尋找EsABCG25，并通過(guò)用RSEM（RNA-Seq by expectation maximization）策略進(jìn)行基因的表達(dá)定量［32］。表達(dá)定量的結(jié)果以FPKM值表示。FPKM法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達(dá)。用TopHat［33］軟件對(duì)EsABCG25在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的可變剪接事件進(jìn)行分析。

1.2.6 逆境脅迫下EsABCG25的Real-time PCR分析 以鹽芥的Tublin作為內(nèi)參基因，對(duì)不同樣品的cDNA模板上樣量進(jìn)行均一化。根據(jù)Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)EsABCG25的特異性引物（Tubulin-F：5'-GCCAATCCGGTGCTGGTAACA-3'和Tubulin-R：5'-CATACCAGATCCAGTTCCTCCTCCC-3'；EsABCG25F：5'-GGGAACGGAGAGGCGATAT-3'和EsABCG25R：5'-AAGTTTAATACGCCTCAAAGCCA-3'）

2 結(jié)果

2.1 EsABCG25的克隆

以擬南芥AtABCG25序列為查詢序列，通過(guò)BLAST比對(duì)篩選鹽芥EST序列并進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)上、下游引物，以鹽芥cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為2.1 kb的特異產(chǎn)物（圖1）并進(jìn)行測(cè)序。該基因的DNA序列以及預(yù)測(cè)其編碼的氨基酸序列已登錄至GenBank，登錄號(hào)為KY111263。

圖1 鹽芥EsABCG25的擴(kuò)增

2.2 EsABCG25的生物信息學(xué)分析

測(cè)序分析表明EsABCG25的cDNA全長(zhǎng)為2154 bp，與擬南芥AtABCG25比對(duì)，發(fā)現(xiàn)EsABCG25含有完整編碼區(qū)。在起始密碼子ATG上游含有78 bp的非編碼區(qū)，終止密碼子TAA下游含有90 bp的非編碼區(qū)，開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）為1983 bp。根據(jù)該基因序列與鹽芥染色體核酸序列的BLASTN結(jié)果，確定該基因位于鹽芥第5染色體上第21935011至第21941152個(gè)核苷酸區(qū)域（圖2-A），包括整個(gè)編碼區(qū)在內(nèi)全長(zhǎng)為6142 bp。對(duì)該基因內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)分析表明，該基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子（圖2-B），4個(gè)外顯子中各有2個(gè)分布在序列的5'端和3'端。上游2個(gè)外顯子分別是第1-205個(gè)核苷酸（205 bp）和第366-1206個(gè)核苷酸（841 bp），下游2個(gè)外顯子分別是第4947-5284個(gè)核苷酸（338 bp）和第5372-6142個(gè)核苷酸（771 bp）。位于基因序列中央的則是長(zhǎng)達(dá)3740 bp的內(nèi)含子序列，位于兩側(cè)的2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度較短，均小于150 bp。

圖2 EsABCG25的染色體定位（A）和基因結(jié)構(gòu)（B）

EsABCG25編碼一個(gè)含660個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為72.6 kD。預(yù)測(cè)該蛋白分子的理論等電點(diǎn)為9.06，含有20種基本氨基酸，其中含量最高的為亮氨酸（Leu），為13.16%；含量最低的是色氨酸（Trp），為1.06%，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)57個(gè)，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)69個(gè)，氨基酸極性的最大值為10.522，最小值為5.600。疏水性分析（圖3-A）表明，氨基酸序列中，第642位的苯丙氨酸（Phe）具有最高的分值2.878和最強(qiáng)的疏水性，而第25位的精氨酸（Arg）則具有最低的分值-2.789和最強(qiáng)的親水性，整個(gè)氨基酸序列疏水值的平均值為0.209，表示EsABCG25分子有較弱的疏水性，這與具有跨膜結(jié)構(gòu)的ABCG家族成員表現(xiàn)出的特征相近。利用SOPMA工具預(yù)測(cè)蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3-B）表明，該蛋白分子由37.82%的α-螺旋、23.75%的延伸鏈、11.04%的β-轉(zhuǎn)角和27.38%的無(wú)規(guī)則卷曲組成，表明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)分子的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。利用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3-C）顯示，EsABCG25分子含有一個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）以及一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），屬于半轉(zhuǎn)運(yùn)器，即屬于WBC型。

圖3 EsABCG25編碼蛋白的疏水性分析（A）與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（B、C）

2.3 EsABCG25的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI Protein Blast數(shù)據(jù)庫(kù)搜索EsABCG25編碼蛋白的同源序列，獲得15種植物的高相似度氨基酸序列。這15種植物的同源序列GenBank登錄號(hào)分別為蕪菁（Brassica rapa，XP_009105860.1）、蘿 卜（Raphanus sativus，XP_018457081.1）、 甘藍(lán)（Brassica oleracea，XP_013592372.1）、 擬 南芥（Arabidopsis thaliana，NP_565030.1）、 亞 麻薺（Camelina sativa，XP_010428049.1）、 醉 蝶花（Tarenaya hassleriana，XP_010521140.1）、 麻風(fēng) 樹(shù)（Jatropha curcas，XP_012065776.1）、 葡萄（Vitis vinifera，XP_002268373.1）、 可 可（Theobroma cacao，EOY17220.1）、 木 薯（Manihot esculenta，XP_021603498.1）、 木 豆（Cajanus cajan，XP_020210384.1）、 絨 毛 煙 草（Nicotiana tomentosiformis，XP_009604112.1）、木本棉（Gossypium arboretum，XP_017603971.1）、 胡 楊（Populus euphratica，XP_011005152.1）和大豆（Glycine max，XP_003555426.1）。比對(duì)結(jié)果（圖4）表明，鹽芥EsABCG25的氨基酸序列與蕪菁同源序列相似度最高，達(dá)92%，其次為甘藍(lán)，相似度為91%；與蘿卜、擬南芥和亞麻薺的同源序列相似度為87%-89%；與醉蝶花同源序列的相似度為79%；與麻風(fēng)樹(shù)、葡萄、可可、木薯、木豆、絨毛煙草、木本棉、胡楊和大豆等植物的同源序列相似性在63%-65%。對(duì)上述序列進(jìn)行多序列比對(duì)的結(jié)果顯示，EsABCG25含有和其他同源序列一致的1個(gè)NBD結(jié)構(gòu)域和1個(gè)TMD結(jié)構(gòu)域。NBD結(jié)構(gòu)域較為保守，含有3個(gè)高度保守的特征元件，分別為Walker A（GPSGSGKST）、Walker B（LDEPTSGLD）和位于二者間的ABC signature（XSGGERKRVSIA）。

圖4 鹽芥EsABCG25編碼蛋白與其他植物ABCG25的氨基酸序列的相似性對(duì)比（部分序列）

采用MEGA5.2的NJ策略構(gòu)建上述16條同源氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。包含鹽芥在內(nèi)的16種植物均屬于雙子葉植物綱，在聚類上分成兩個(gè)大分支。其中一個(gè)分支內(nèi)的7種植物中有6種為十字花科植物：鹽芥EsABCG25與同屬于十字花科的蘿卜、蕪菁、甘藍(lán)的同源序列因親緣關(guān)系很近而聚在一起，相似性也在89%以上。但在這4種植物的聚類中，其他3種之間相對(duì)于鹽芥更加相近；而另外兩種十字花科植物擬南芥和亞麻薺的同源序列相比于前四者在親緣上更加接近；此外，來(lái)自白菜花科醉蝶花屬的醉蝶花的同源序列（與EsABCG25相似性為79%），相比于其他科植物，與鹽芥等十字花科植物更接近。另一個(gè)分支中，屬于豆科、大戟科等7科的可可、木本棉、胡楊、麻風(fēng)樹(shù)、木薯、葡萄、絨毛煙草、大豆和木豆等9種植物的同源序列聚類在一起，與EsABCG25的相似性均小于65%，親緣上離鹽芥相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖5 鹽芥EsABCG25編碼蛋白與其他植物ABCG25蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 EsABCG25組織特異性和抗逆性相關(guān)表達(dá)分析

為了解鹽芥不同部位EsABCG25的表達(dá)情況，用正常條件下生長(zhǎng)的鹽芥根部、蓮座葉、莖生葉、莖部、花和角果等6種組織RNA構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，比對(duì)至鹽芥基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)特定統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以FPKM值為指標(biāo)，確定各組織中EsABCG25的表達(dá)豐度。如圖6-A，鹽芥植株的6種組織中EsABCG25均有一定程度的表達(dá)，其中EsABCG25在莖的表達(dá)豐度最高，而蓮座葉中表達(dá)豐度最低，前者表達(dá)豐度是后者的11倍。

此外，該基因在同為運(yùn)輸通道的根部中也有較高轉(zhuǎn)錄水平，約為莖的一半，是蓮座葉的5.5倍。在莖生葉和花當(dāng)中的表達(dá)豐度則較低。用TopHat軟件鑒定EsABCG25在各組織中轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生的可變剪接事件，結(jié)果（圖6-B）顯示，在6種組織中都發(fā)現(xiàn)了該基因的可變剪接事件，除莖之外其他5種組織中均鑒定出2個(gè)可變剪接事件，類型分別是首個(gè)外顯子可變（Alternative first exon）和內(nèi)含子保留（Intron retention）；而在莖中則只鑒定出首個(gè)外顯子可變事件。

圖6 EsABCG25在鹽芥不同組織中的表達(dá)情況（A）與可變剪接事件數(shù)（B）

為了研究不同逆境脅迫對(duì)EsABCG25表達(dá)的影響，對(duì)4周齡的鹽芥植株分別進(jìn)行200 mmol/L NaCl，4℃低溫，以及自然干旱等脅迫，此外還實(shí)施了50 μmol/L ABA處理。分別提取各處理組及對(duì)照組的葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)Real time-PCR分析EsABCG25的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，在不同逆境脅迫處理后，鹽芥葉片EsABCG25表達(dá)水平有了不同的變化趨勢(shì)。鹽脅迫12 h時(shí)，EsABCG25表達(dá)水平是正常生長(zhǎng)條件下的3.4倍，當(dāng)脅迫再增加12 h后，基因表達(dá)水平回落至正常水平的1.4倍，而鹽脅迫持續(xù)至1周后，基因表達(dá)持續(xù)下調(diào)，降到脅迫前水平的80%（圖7-A）。當(dāng)干旱脅迫達(dá)到1周時(shí)，EsABCG25表達(dá)水平顯著降低，為正常條件下的29%，而持續(xù)干旱2周后，其表達(dá)又增加至近似于原來(lái)程度（圖7-B）；與鹽脅迫不同的是，在4℃條件維持12 h后，EsABCG25的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，為脅迫前的56%，但脅迫持續(xù)至24 h時(shí)，表達(dá)水平上升至正常水平的1.7倍，在4℃下生長(zhǎng)一周后，表達(dá)再次下調(diào)至脅迫前的70%（圖7-C）。此外值得注意的是，在ABA處理12 h后，鹽芥葉片EsABCG25的表達(dá)水平上升至處理前的8.8倍；持續(xù)處理24 h后，該基因表達(dá)又恢復(fù)至近似正常條件下水平，持續(xù)處理至1周，EsABCG25仍保持正常表達(dá)水平（圖7-D）。

圖7 EsABCG25在不同脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

本研究以擬南芥AtABCG25序列為參照，從鹽芥EST數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了與AtABCG25同源性較高的鹽芥EST拼接序列。這種通過(guò)已知的近緣物種同源基因序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)手段，對(duì)EST數(shù)據(jù)進(jìn)行延伸分析的方法，能夠有效地促進(jìn)新基因的發(fā)現(xiàn)和基因功能的研究。但這種以生物信息學(xué)方法獲得的基因信息，須通過(guò)分子遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。本研究中，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)上下游引物，以鹽芥cDNA為模板，首次克隆出特異性的全長(zhǎng)序列并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，將之命名為EsABCG25。鹽芥基因組和EST序列信息的不斷增加和完善，為尋找和克隆更多的鹽芥ABCG成員的基因序列，完善鹽芥ABCG亞家族信息奠定了基礎(chǔ)。在通過(guò)高通量測(cè)序文庫(kù)搜索EsABCG25信息的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了另一條與EsABCG25序列相近，但編碼區(qū)長(zhǎng)度要短得多的 cDNA序 列（1296 bp，XM_006390661）， 對(duì) 該cDNA編碼蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其末端含一個(gè)NBD結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，其預(yù)測(cè)功能與EsABCG25相似，二者在結(jié)構(gòu)和功能上的潛在異同有待更多研究。目前已知擬南芥131個(gè)ABC家族基因中ABCG亞家族基因有44個(gè)［8］。作為擬南芥的近緣物種，鹽芥比前者多2條染色體，考慮到鹽芥具有更強(qiáng)的抗逆性以及ABCG成員廣泛參與植物逆境響應(yīng)機(jī)制的特點(diǎn)［34-35］，鹽芥ABCG亞家族成員在數(shù)量和功能上可能會(huì)更加豐富，且與鹽芥抗逆境機(jī)制的關(guān)系會(huì)更加密切，有待進(jìn)一步的挖掘。

EsABCG25二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，它含有一個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），說(shuō)明其屬于ABCG亞家族的半分子轉(zhuǎn)運(yùn)器（WBC型）［9］。這一類轉(zhuǎn)運(yùn)器需要以雙分子的形式才能發(fā)揮功能。朱璐等［36］對(duì)擬南芥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的信息和功能分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥ABCG亞家族中，28個(gè)成員屬于WBC型。WBC型可以與自己聚合形成同源二聚體，也可以與其他WBC型成員聚合成異源二聚體。已有研究發(fā)現(xiàn)AtABCG11可以形成同源二聚體，而AtABCG12只能與AtABCG11結(jié)合為異源二聚體行使轉(zhuǎn)運(yùn)功能；AtABCG14只能嚴(yán)格的與AtABCG11形成異源二聚體，而AtABCG11可以形成同源二聚體或者和AtABCG9結(jié)合成異源二聚體發(fā)揮功能［37-40］。EsABCG25為WBC型的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也必然以同樣方式發(fā)揮功能，因此，需進(jìn)一步探究其形成二聚體的方式和對(duì)象。從而了解其發(fā)揮功能的機(jī)制。

通過(guò)EsABCG25編碼氨基酸序列與其他植物同源序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，EsABCG25具有與其他分子高度相似的NBD，包含3個(gè)特征元件Walker A、Walker B和ABC signature，這一區(qū)域在各植物間是高度保守的。NBD作為核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，功能是與ATP結(jié)合，為轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量來(lái)源［41］，其高度保守性表明這一功能的普遍性。從進(jìn)化樹(shù)可以看到，來(lái)自于不同物種的ABCG25氨基酸序列構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與傳統(tǒng)的植物學(xué)分類相吻合。此外，雖然EsABCG25是以擬南芥AtABCG25為參照基因克隆到的，但進(jìn)化樹(shù)顯示，相對(duì)于擬南芥，EsABCG25與同科的另外2種植物蕪菁和甘藍(lán)的同源序列相似度更高，而相對(duì)地，擬南芥與亞麻薺同源序列最為接近。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，TMD承擔(dān)跨膜功能，是其執(zhí)行運(yùn)輸功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，且參與轉(zhuǎn)運(yùn)底物的識(shí)別［42］。如ABC家族成員ABCA1是細(xì)胞抗砷的關(guān)鍵蛋白之一［43］，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白的特異性抗砷結(jié)構(gòu)位于TMD2的胞外第六α-螺旋環(huán)上，構(gòu)建該區(qū)域的缺失突變導(dǎo)致細(xì)胞排砷功能顯著下降［44］。根據(jù)多序列比對(duì)的結(jié)果，推測(cè)ABCG25在系統(tǒng)進(jìn)化上的變化有可能來(lái)源于變異頻率更高的TMD結(jié)構(gòu)域上，這一區(qū)域的變異程度可能導(dǎo)致ABCG25在不同植物中轉(zhuǎn)運(yùn)功能與效率上的差異。

對(duì)AtABCG25的研究發(fā)現(xiàn)其主要分布于擬南芥的維管組織當(dāng)中，且參與了擬南芥內(nèi)源ABA的轉(zhuǎn)運(yùn)與相關(guān)響應(yīng)機(jī)制［19］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建的AtABCG25過(guò)表達(dá)突變體植株的葉表面保衛(wèi)細(xì)胞的ABA信號(hào)顯著增強(qiáng)，且植株的水分利用效率明顯上升，使擬南芥植株對(duì)干旱的耐受性增強(qiáng)［20］。本研究表明該基因在莖和根當(dāng)中的表達(dá)水平非常高，是蓮座葉的數(shù)倍。這與Kuromori等［19-20］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出一致性。脅迫表達(dá)試驗(yàn)表明，EsABCG25對(duì)于多種逆境均產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)，但對(duì)于外源ABA脅迫的響應(yīng)尤為顯著，且EsABCG25在ABA脅迫的較早期（12 h），表達(dá)水平迅速上升，但1 d后，其表達(dá)水平又回歸至正常且長(zhǎng)期不變，相較于其他脅迫，EsABCG25對(duì)于ABA的響應(yīng)更顯著且更早。這暗示EsABCG25在功能上與AtABCG25的相似性。綜上，推測(cè)EsABCG25很可能通過(guò)直接參與鹽芥對(duì)ABA信號(hào)的響應(yīng)進(jìn)而引發(fā)鹽芥對(duì)其他逆境的耐受機(jī)制。

可變剪接作為基因轉(zhuǎn)錄后修飾的一種方式，普遍存在于真核生物中。隨著研究的深入，可變剪接逐漸被認(rèn)可為一種能夠增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能多樣性的重要機(jī)制［45］。目前認(rèn)為可變剪接通過(guò)產(chǎn)生選擇性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，改變有功能和無(wú)功能轉(zhuǎn)錄本的比率，以及產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)參與競(jìng)爭(zhēng)等方式增加了基因表達(dá)多樣性［46］?？勺兗艚釉谥参锏纳L(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［47-48］。本研究在鹽芥的不同組織中均發(fā)現(xiàn)了EsABCG25的可變剪接事件，這些事件使其表達(dá)產(chǎn)生不同的結(jié)果，其生物學(xué)意義有待繼續(xù)探討。

鹽芥與擬南芥具有相似遺傳背景并表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆境能力。EsABCG25作為鹽芥中新的ABC蛋白基因被發(fā)現(xiàn)，有必要進(jìn)一步研究其詳細(xì)功能以及其功能在分子水平上的執(zhí)行機(jī)制。

4 結(jié)論

從鹽芥中克隆獲得cDNA全長(zhǎng)序列2154 bp的EsABCG25（GenBank登錄號(hào) KY111263）。該基因定位于鹽芥第5染色體，全長(zhǎng)6142 bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。該基因編碼一個(gè)含660個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白分子呈現(xiàn)弱疏水性，含有一個(gè)NBD和一個(gè)TMD結(jié)構(gòu)域，與同科植物蕪菁的同源蛋白親緣關(guān)系最近，具有ABCG家族典型特征。該基因在鹽芥莖部表達(dá)最為豐富，且在各組織中均有可變剪接事件；同時(shí)其表達(dá)受到多種逆境的誘導(dǎo)，尤其受脫落酸的明顯誘導(dǎo)，與鹽芥的抗逆性關(guān)系密切。