小花棘豆與玉米混貯微生物特性及脫除苦馬豆素乳酸菌的篩選

陶雅，李峰，孫啟忠，柳茜，高潤，徐春城

(1.中國農業(yè)科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010；2.中國農業(yè)大學工學院，北京 100083；3.涼山彝族自治州畜牧獸醫(yī)研究所，四川 西昌 615042)

小花棘豆(Oxytropisglabra) 是豆科棘豆屬多年生草本植物，根系發(fā)達，多生長在典型草原、荒漠草原以及荒漠低濕地區(qū)，是輕度耐鹽堿植物[1-3]。就目前的資料報道來看, 全國棘豆生長面積不下334萬 hm2，據測算, 產草量約1050 kg·hm-2(按中等情況)[4]。小花棘豆在整個生長期均有毒，在干旱年份，其他牧草生長稀疏，而小花棘豆由于根系發(fā)達生長茂盛，放牧牲畜常常由于饑餓而被迫采食，最終造成中毒，給牧民造成嚴重的經濟損失。然而許多有毒植物是重要的經濟作物，或具有潛在的重要經濟價值，屬于應用植物范疇。小花棘豆營養(yǎng)豐富，蛋白質含量高，富含多種礦物質，是具有豐富營養(yǎng)價值的飼料資源[5]，如能作為飼料利用，可產生巨大的經濟效益。

青貯是牧草最常利用的貯藏方式之一，由于小花棘豆可溶性碳水化合物含量低，蛋白質含量和緩沖能高，單獨青貯不易成功，與玉米(Zeamays)混貯是提高豆科等高蛋白含量牧草青貯成功率的手段之一[6-7]。成功的青貯還可以降低有毒植物中生物堿等有毒化合物的含量[8-9]，減少動物采食后中毒風險[10]，經青貯飼喂試驗發(fā)現(xiàn)，青貯后的小花棘豆不僅不引起山羊中毒，而且還有較好的育肥效果[11]。青貯過程是各種微生物共同作用的結果[12-14]，目前單一青貯中微生物活動特性研究較多[15-17]，而混合青貯對發(fā)酵體系內微生物的影響報道較少，不同比例混貯如何通過改變微生物特性，提高青貯成功率尚不明晰。

部分研究發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)等具有降解苦馬豆素的活性[18-20]。在青貯過程中乳酸菌起主導作用，促進發(fā)酵，是一種有益微生物，其是否能降低苦馬豆素活性尚不明確，此外小花棘豆青貯體系中的乳酸菌對苦馬豆素有很強的適應性，因此從其中挑選具有降低苦馬豆素活性的乳酸菌成功率較高。本試驗旨在研究小花棘豆與全株玉米按不同比例混貯微生物特性及乳酸菌多樣性差異，挖掘具有脫除苦馬豆素活性的乳酸菌，為小花棘豆青貯飼料的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料收獲于2015年8月12日，小花棘豆采自內蒙古鄂爾多斯市烏審旗天然草地(N 38.38°、E 109.03°)，于盛花期刈割，全株玉米于蠟熟期采自附近農戶田間。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，共設8個處理，每個處理3個重復，詳見表1。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.3 青貯調制

分別將收獲后的小花棘豆和全株玉米切短至2～3 cm，按不同處理比例充分混合均勻，以四分法選取適量的樣品裝入聚乙烯袋內，每袋約200 g，用真空包裝機抽成真空并封口，室溫條件下放置60 d 后開封取樣分析。

1.4 試驗方法

1.4.1微生物計數(shù) 采用稀釋平板涂布法對不同比例混合的小花棘豆與玉米原料以及青貯材料中微生物菌群進行計數(shù)。稱取5 g待測樣品，放入裝有45 mL 無菌水的三角瓶內，震蕩均勻，并用無菌水進行10倍梯度稀釋，分別吸取稀釋10、103和105倍的菌懸液20 μL，均勻涂于MRS、BLB、NA和PDA平板培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)上，涂菌后的MRS平板于37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，計測生長出的乳酸菌菌落數(shù)，BLB、NA和PDA平板則直接置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，48 h后分別計測腸細菌、好氧細菌、酵母菌和霉菌的菌落數(shù)量。

1.4.2乳酸菌的分離與純化 挑取MRS培養(yǎng)基上生長的典型單菌落，在MRS平板上反復劃線分離，直到獲得該菌的純培養(yǎng)。分別對分離出的菌株進行革蘭氏染色[21]和過氧化氫酶試驗[22]。并認定呈革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株為疑似乳酸菌，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3乳酸菌生理生化特性 乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產氣試驗參照凌代文等[22]方法進行。將待測菌株的24 h培養(yǎng)物接種到不同溫度(10、15、40、45 ℃)、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、8.0)和NaCl 濃度(3.0%和6.5%)的MRS液體培養(yǎng)基中，觀測生長情況[23]。利用API 50CH試劑條檢測乳酸菌對49種碳源發(fā)酵特性。

1.4.4乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進化樹的構建 利用天根細菌全基因組DNA 提取試劑盒提取待測乳酸菌的全基因組DNA，并以該DNA為模板，應用27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′)引物序列對乳酸菌16S rDNA 進行PCR擴增，PCR反應體系(50 μL)為：引物27f和1492r(10 μmol·L-1)各2 μL，模板5 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O補充至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃，預變性5 min；94 ℃，變性50 s；55 ℃，退火50 s；72 ℃，延伸2 min，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，并送上海桑尼生物科技有限公司進行一代測序。

本系統(tǒng)集多生命體征采集傳感技術、無線傳感技術、MCU、數(shù)字信號處理技術、遠程Web 監(jiān)護平臺開發(fā)、包括生理數(shù)據的采集與傳輸、服務器搭建、數(shù)據庫的建立以及基于機器學習的數(shù)據建模與數(shù)據分析可視化的效果展示等組成，其中系統(tǒng)組成圖如圖4 所示。

1.5 乳酸菌對苦馬豆素脫除率的測定

稱取1 kg全株小花棘豆和1000 mL 去離子水置于破壁機內打碎成漿，用6層紗布過濾，制成小花棘豆汁液，121 ℃ 滅菌15 min。將活化后的乳酸菌用無菌水調節(jié)菌體濃度至1.0×109cfu·mL-1，將其分為兩組，Ⅰ組菌懸液不做任何處理，Ⅱ組菌懸液在100 ℃加熱15 min 滅活，分別?、?、Ⅱ組菌懸液3 mL 離心(6000 r·min-1，4 ℃，5 min)收集菌體，加入3 mL滅菌的小花棘豆汁液中，于37 ℃發(fā)酵48 h，離心(6000 r·min-1，4 ℃，5 min)，過膜(0.22 μm 水溶膜)后待測，同時設無菌對照組，對照組苦馬豆素含量為48 μg·mL-1。

采用氣相色譜內標法測定小花棘豆發(fā)酵液中的苦馬豆素含量，氣相色譜儀：瓦里安(varian)，3800GC型；色譜柱：AT.SE-54石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.33 μm)；檢測器：FID；載氣：氮氣；進樣口溫度：260 ℃；柱溫：210 ℃;FID：280 ℃；載氣流速：2 mL·min-1；分流比：30。衍生化處理：衍生化試劑(BSTFA∶TMCS=99∶1)，與待測液以1∶1 比例混合，衍生化3～5 h，用0.45 μm濾膜過濾，進樣。

1.6 數(shù)據分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用一般線性模型作兩因素方差分析，并作Duncan多重比較。將測序獲得的菌株序列信息利用Blast檢索系統(tǒng)在GenBank數(shù)據庫和EzTaxon 數(shù)據庫中進行比對，選擇適當數(shù)量與目的基因序列同源性較高的標準菌株16S rDNA序列，與待測菌株的16S rDNA序列共同用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 小花棘豆與玉米混貯前后微生物菌群對比

小花棘豆與玉米按照不同比例混合原料中乳酸菌數(shù)量隨著玉米混入量的增加逐漸升高，小花棘豆上附著的乳酸菌數(shù)量只有105cfu·g-1FM，當混合比例為T3時乳酸菌的數(shù)量達到了106cfu·g-1FM，原料中乳酸菌數(shù)量顯著低于青貯飼料中的乳酸菌數(shù)量(P<0.05)，青貯飼料各處理間乳酸菌數(shù)量無顯著差異。原料中的腸細菌約為106cfu·g-1FM，各處理間無顯著差異，經過青貯發(fā)酵后腸細菌均未檢測到。好氧細菌數(shù)量在原料和青貯飼料中均隨著玉米比例的增加逐漸減少，但并未因青貯發(fā)酵而顯著降低。酵母菌數(shù)量在各處理間均無顯著差異，青貯飼料中的酵母菌略低于原料，但是無顯著差異。原料中的霉菌數(shù)量隨著玉米混入比例增加逐漸增加，而青貯飼料中的霉菌數(shù)量均在檢出線以下(表2)。

2.2 小花棘豆與玉米按不同比例混貯對乳酸菌多樣性的影響

2.2.1乳酸菌的生理生化特性 從小花棘豆與玉米混貯試驗分離出的乳酸菌生理生化特性見表3和4，利用生理生化特性和碳源發(fā)酵實驗結果，將原料中分離出的4株乳酸菌菌株劃分為3個組：Ⅰ組代表菌株JD3B，Ⅱ組代表菌株BJD4A，Ⅲ組代表菌株CJD10A，將從青貯飼料中分離出的9株乳酸菌菌株劃分為4個組：Ⅳ組代表菌株JD2E，Ⅴ組代表菌株JD1D，Ⅵ組代表菌株JD10D和Ⅶ組代表菌株JD6E。所有菌株均表現(xiàn)為革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性，除JD1D發(fā)酵葡萄糖產生氣體，為異型發(fā)酵乳酸菌外，其余菌株均為同型發(fā)酵乳酸菌；菌株JD3B、JD4A和JD10A為乳酸桿菌，JD2E、JD1D、JD10D和JD6E為乳酸球菌；各菌株在5 ℃環(huán)境下不生長，但均可在40 ℃環(huán)境中生長，菌株JD2E和JD1D能夠在10 ℃環(huán)境下生長，JD4A和JD10D可在45 ℃下生長；在含3.0%和6.5% NaCl 的環(huán)境中，各菌株均可正常生長；所有菌株不能在pH值為3.0的環(huán)境中生長，大部分菌株可在pH 值為4.0～8.0的范圍內生長，只有JD2E、JD1D在pH 值4.0、JD10A在pH 值8.0環(huán)境下微弱生長。

表2 小花棘豆與玉米混貯微生物數(shù)量對比Table 2 Microbiological analysis of the O. glabra and corn mixed silage in different proportions (log cfu·g-1 FM)

SEM: 均值標準誤差 Standard error of means; ND: 未檢出 Not detected; NS: 無顯著差異 Not significant; *:P<0.05； **:P<0.01；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 The different lowercase in the same column indicate significant differences at theP<0.05 level.

表3 乳酸菌的生理生化特性Table 3 The physiological biochemical characteristics of lactic acid bacteria strains

續(xù)表3 Continued Table 3

+: 生長Positive; -: 不生長Negative; w: 微弱生長Weakly positive.

表4 乳酸菌API 50 CH 碳源發(fā)酵Table 4 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strains

+: 90%菌株為陽性90% or more of the strains are positive; -: 90% 菌株為陰性90% or more of the strains are negative; w: 弱陽性Weakly positive.

各代表菌株對49種碳源利用情況見表4，菌株JD3B可以利用21種碳源，JD4A可以利用19種碳源，JD10A可以利用25種碳源，JD2E可以利用30種碳源，JD1D可以利用13種碳源，JD10D可以利用27種碳源，它們的共同點是均可利用L-阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、果糖、N-乙酰-葡糖胺、熊果苷、七葉靈、纖維二糖和麥芽糖這9種碳源，而菌株JD6E僅可以利用半乳糖、葡萄糖、果糖、七葉靈、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉8種碳源，該菌株可以很好地發(fā)酵淀粉， 其他菌株則表現(xiàn)為不能利用或弱陽性；所有菌株都不能利用赤廯醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿東醇、β-甲基-D-木糖甙、山梨糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、菊糖、肝糖、木糖醇、D-來蘇糖、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、L-阿拉伯糖醇；僅菌株JD2E能夠利用鼠李糖和棉籽糖，較菌株JD3B，JD2E可以更好地利用鼠李糖、山梨醇、蜜二糖、松三糖、棉籽糖、D-松二糖和葡萄糖酸鹽。JD10A可以利用其他菌株利用不了的α-甲基-D-葡萄糖苷，相對于其他2株球菌，該菌株能夠更好地利用蜜二糖，但是卻發(fā)酵不了蔗糖；7株乳酸菌中僅有JD10D 不能利用D-木糖，JD1D不能利用乳糖、半乳糖、甘露糖、柳醇、龍膽二糖和海藻糖。

表5 乳酸菌株 16S rDNA 序列Blast比對Table 5 Blast results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

圖1 基于 16S rDNA 序列分析結果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可以看出，7組乳酸菌代表菌株隸屬于Lactobacillus和Lactococcus2個屬。Lactobacillus包括菌株JD2E、JD1D、JD10D和JD6E，其中JD1D與Lactobacillusbrevis構成同一分支，相似度達99.39%；菌株JD10D與Lactobacilluspentosus的系統(tǒng)進化位置最接近，相似度高達100.00%；菌株JD2E與Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum處于同一進化分支上，相似度為99.89%；菌株JD6E與Lactobacillusamylovorus構成同一分支，相似度達99.58%。菌株JD3B、JD4A和JD10A隸屬于Lactococcus，分屬于3個種，其中JD10A和Lactococcustaiwanensis構成一個分支，序列相似度為99.86%；JD3B與Lactococcuslactissubsp.hordniae處于同一進化分支上，相似度可達99.93%；JD4A與Lactococcuslactissubsp.lactis的系統(tǒng)進化位置最接近，相似度為99.86%。

2.2.3小花棘豆與玉米按不同比例混貯對乳酸菌多樣性的影響 小花棘豆與玉米按照不同比例混合原料與青貯飼料中存在的乳酸菌見表6，從各處理原料中分離出的乳酸菌均為乳酸球菌，包括Lac.lactissubsp.hordniae、Lac.taiwanensis和Lac.lactissubsp.lactis其中Lac.lactissubsp.hordniae為優(yōu)勢種類，存在于每個處理的原料中，Lac.taiwanensis僅存在于處理T6中，Lac.lactissubsp.lactis僅存在于玉米原料上，當玉米混入比例升高時，原料中乳酸菌多樣性有所增加。經過青貯發(fā)酵后的青貯飼料中分離出的乳酸菌均為乳酸桿菌，包括L.brevis、L.pentosus、L.plantarumsubsp.plantarum和L.amylovorus， 其中L.plantarumsubsp.plantarum為優(yōu)勢種類，存在于每個混貯比例的青貯飼料中，其次是L.brevis，除了玉米、小花棘豆單貯以及處理T7中未分離到，存在于絕大部分混合比例的青貯飼料中，L.amylovorus只存在于小花棘豆含量高的青貯飼料中(T1和T2)，而L.pentosus僅存在于處理T3的青貯飼料中，當玉米混入比例升高時，青貯飼料中乳酸菌多樣性有所下降。

表6 乳酸菌多樣性Table 6 Diversity of lactic acid bacteria

2.3 脫除苦馬豆素乳酸菌的篩選

從原料和青貯飼料中分離出的乳酸菌株在小花棘豆汁液中發(fā)酵48 h后對苦馬豆素脫除率見表7，不同乳酸菌菌株對苦馬豆素的脫除率均高于85%，其中菌株JD6E、JD4D、JD10D 、JD2E和JD1F對苦馬豆素的脫除率高達100.00%。經過熱處理后，菌株JD10D和JD2E對苦馬豆素的脫除率幾乎沒有變化，分別為100.00%和97.76%，而其他菌株對苦馬豆素的脫除作用均顯著減弱(P<0.01)，脫除率下降31.76%～100.00%，其中菌株JD6D和JD1E經過熱處理后對苦馬豆素的脫除率分別下降到2.17%和0。

3 討論

表7 不同菌株苦馬豆素脫除率Table 7 Percentage of SW decrease rate by different strains fermentation

**，P<0.01熱處理組與未處理組對比。

**,P<0.01 comparison between heat treatment and no treatment.

青貯是乳酸菌利用青貯原料中的糖類物質并將其轉化成為乳酸，通過降低pH 控制不良微生物生長，從而減少營養(yǎng)物質損失的過程[24]。因此附生于植物表面的微生物，特別是附生的乳酸菌是開啟青貯發(fā)酵過程的關鍵因素，并影響青貯發(fā)酵品質[25-26]。當青貯原料上附著的乳酸菌數(shù)量達105cfu·g-1FM時才能達到良好的發(fā)酵效果[27]，新鮮牧草上附生的乳酸菌數(shù)量一般為104～105cfu·g-1FM，玉米上附生的乳酸菌數(shù)量高達106～107cfu·g-1FM，較其他牧草提高了30%[28-29]，本研究中小花棘豆上附生的乳酸菌數(shù)量為105cfu·g-1FM，玉米上附著的乳酸菌數(shù)量為106cfu·g-1FM，將二者混合可提高青貯原料中的乳酸菌數(shù)量，當玉米混入比例達到20%時，原料中乳酸菌的數(shù)量可達到106cfu·g-1FM，可以更好地促進乳酸發(fā)酵。青貯60 d后，各混合處理乳酸菌數(shù)量均有所上升，但沒有顯著差異，均達到107cfu·g-1FM，即發(fā)酵時間充分時，各混合處理青貯前乳酸菌數(shù)量雖有異，卻并不會影響最終乳酸菌的數(shù)量。這可能是由于青貯進入穩(wěn)定期時，由于受到低pH和乳酸發(fā)酵產物的抑制，乳酸菌數(shù)量會從其峰值下降[30]，雖然峰值及出現(xiàn)時間不同，但當發(fā)酵完成后pH等條件相似時乳酸菌數(shù)量也相差不多。有研究認為青貯發(fā)酵是否充分與青貯前原料中乳酸菌的種類和數(shù)量無關[31]，但大量研究證實青貯前乳酸菌的種類和數(shù)量能夠影響青貯發(fā)酵品質[32-33]。除乳酸菌外好氧細菌、腸細菌、酵母菌和霉菌是植物表面附著的主要微生物，數(shù)量分別為>107cfu·g-1FM，103～106cfu·g-1FM、103～105cfu·g-1FM和103～104cfu·g-1FM。本研究中小花棘豆與玉米按照不同比例混合原料中好氧細菌、腸細菌、酵母菌和霉菌的數(shù)量分別為106～107cfu·g-1FM、105～106cfu·g-1FM、105～107cfu·g-1FM和103cfu·g-1FM，基本與前人研究相符[30]，只有酵母菌數(shù)量略高。經過青貯發(fā)酵，腸細菌和霉菌由于酸性及厭氧環(huán)境的產生基本消失[30]，但好氧細菌和酵母菌變化不顯著，酸性和厭氧環(huán)境只是抑制其生長和增殖，但并沒有降低數(shù)量[34]。添加玉米雖然對各處理原料和青貯飼料中酵母菌數(shù)量影響較小，但是可以顯著降低好氧細菌的數(shù)量，從一定程度上有助于提高青貯成功率。

Lin等[31]研究發(fā)現(xiàn)新鮮玉米植株表面附著的乳酸菌主要為Lactobacillusplantarum,Pediococcuspentosaceus,Enterococcusfaecium和Enterococcusfaecalis，Ruser[35]對大量切碎的玉米樣品分析認為Lactobacillus和Leuconostoc是主要類群。Ennahar等[36]發(fā)現(xiàn)飼料稻青貯中同型發(fā)酵的Lactobacillus、Lactococcus和異型發(fā)酵的Leuconostoc的乳酸菌數(shù)量較多, Pang等[23]從玉米秸稈青貯中分離的乳酸菌中L.plantarum,L.pentosus和L.brevis占86%是優(yōu)勢種類。本研究從各處理原料中只分離出了乳球菌屬的3個種，分別是Lac.lactissubsp.hordniae、Lac.taiwanensis和Lac.lactissubsp.lactis。從青貯飼料中分離出乳桿菌屬的4個種，L.brevis、L.pentosus、L.plantarumsubsp.plantarum和L.amylovorus?？梢娫谛迈r樣品中乳酸球菌為優(yōu)勢種類，經過青貯發(fā)酵后，乳酸桿菌演替為優(yōu)勢菌群[34]，有研究表明，青貯原料在收獲制作成青貯飼料后，最先進行發(fā)酵的是Streptococcusfaecalis和Leuconostocmesenteroides，接著被更耐酸的菌株，如L.plantarum、L.brevis和Lactobacillusbuchneri等取代[37]，本研究從原料中分離出的3株乳酸球菌在pH 4.0條件下均可生長良好，其耐酸性能并不亞于青貯飼料中分離出的乳酸桿菌，因此青貯過程中pH下降并不是導致乳酸球菌被乳酸桿菌取代的原因。L.plantarumsubsp.plantarum可利用的碳源種類最多，達30種，較青貯飼料中分離出的其他菌株能夠更好地利用二糖、三糖等多糖，可使其在有限的碳源中更加迅速地生長與增殖，這也可能是該菌成為青貯飼料中優(yōu)勢種群的原因之一。隨著玉米混入比例增加，原料中分離出的乳酸菌種類從1種增加到了2種，乳酸菌多樣性增加可以更全面地促進發(fā)酵，提高初始發(fā)酵速度；而在青貯飼料中隨玉米比例升高，分離得到的乳酸菌種類則從2～3種降低到了1種，乳酸菌多樣性下降，這可能是由于混合原料中可溶性碳水化合物含量越高，乳酸菌可利用的發(fā)酵底物就會越充足，乳酸菌發(fā)酵形成的酸類物質增加，導致青貯發(fā)酵體系的pH 下降，可以生長的乳酸菌種類逐漸減少，使菌群趨于單一化。

微生物對有毒有害物質的脫除作用可分為吸附作用[38-39]和生理生化代謝作用[40-42]，吸附作用通過減少動物腸道對有毒物質的吸收降低毒害作用，而生理生化代謝作用則是直接降解或轉化有毒物質含量來降低毒害作用。本研究中乳酸菌對苦馬豆素均有脫除作用，且經過熱處理滅活后，部分菌株JD10D和JD2E對苦馬豆素的脫除率幾乎沒有變化，說明該菌株對苦馬豆素的脫除作用與菌體活性無關，是一種物理性質的吸附作用。Haskard等[43]認為乳酸菌可以通過一種較弱的非共價鍵吸附黃曲霉毒素B1，韓鵬飛等[44]指出微生物吸附真菌毒素與其復雜的細胞壁結構相關，通過不同的作用力形成微生物-毒素的復合體。除去JD10D和JD2E外供試的其他菌株經過熱處理后對苦馬豆素的脫除作用則顯著減弱，苦馬豆素含量下降與菌體活力密切相關，說明同時存在一種生理生化代謝作用引起的苦馬豆素化學結構的改變，其中該作用最強的菌株為JD6D和JD1E，失去活性后的菌株對苦馬豆素幾乎沒有脫除作用，因此該菌只能通過代謝作用改變苦馬豆素化學結構而不能吸附苦馬豆素。Takahashi-Ando等[45]研究發(fā)現(xiàn)螺旋聚孢屬中的Clonostachysrosea可通過產生一種水解酶將玉米赤霉烯酮轉化為另一種毒性較低的化合物。此外同一種乳酸菌不同菌株間的吸附能力和生理生化代謝作用也存在差異，菌株JD2E和JD1F均為L.plantarumsubsp.plantarum，對苦馬豆素的脫除率高達100%，但是JD2E脫除方式以吸附作用為主，失活菌株吸附率高達97.76%，而JD1F則依靠活性菌體的生理生化代謝作用脫除苦馬豆素，失活菌株吸附率僅為4.06%。可見乳酸菌脫除苦馬豆素的方式和能力因菌株而異，具有菌株特異性[38]。

4 結論

小花棘豆與玉米混貯可以增加青貯原料中乳酸菌的數(shù)量及多樣性，降低青貯飼料和原料中好氧細菌的數(shù)量，有助于提高青貯成功率；在小花棘豆與玉米混合各處理原料中Lactococcus是青貯發(fā)酵的啟動菌，其中Lactococcuslactissubsp.hordniae為優(yōu)勢種類，經過青貯發(fā)酵到達穩(wěn)定期后，Lactobacillus演替為優(yōu)勢菌群，其中Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum為優(yōu)勢種類；乳酸菌對苦馬豆素具有良好的脫除效果，菌株JD10D和JD2E對苦馬豆素的吸附脫除作用最強，而菌株JD6D和JD1E對苦馬豆素的生理生化降解作用最強，均可用作小花棘豆青貯脫除苦馬豆素的發(fā)酵菌株。