自擬黃芪葛根湯治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力大鼠的免疫機(jī)制研究*

錢(qián)立鋒 姚 青 王曉燕 左 瑞

1 浙江省嘉興市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 嘉興 314001 2 陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院 陜西 西安 710021

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療重癥肌無(wú)力（MG）大多只能控制癥狀，且療效報(bào)道不一，該病缺乏徹底根治的療法,病情嚴(yán)重時(shí)危及生命。筆者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)試從免疫學(xué)指標(biāo)初步探索其內(nèi)在的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療MG的有效性提供客觀的依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF三級(jí)8周齡Lewis大鼠50只，雌性，體重171～185g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：012，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)喂養(yǎng)無(wú)菌水和標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌顆粒飼料，所有大鼠毛色光滑潤(rùn)澤，足底紅潤(rùn)，反應(yīng)敏捷。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥物：鼠源性AChR-α亞基97-116肽段序列，純度：98.26%，規(guī)格：5mg/支，由武漢星皓醫(yī)藥公司提供；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、磷酸緩沖液（PBS）由德國(guó)SIGMA公司提供；阿托品注射液（東北制藥集團(tuán)）；新斯的明注射液（上海信誼藥廠）；強(qiáng)的松片（浙江仙琚制藥有限公司）；Rat AChR-Ab、IL-6 ELISA 試劑盒（上海UNIV-Bio科技公司）；自擬黃芪葛根湯(生黃芪、葛根、桂枝、赤芍、炒白術(shù)、茯苓、山萸肉、紅參、補(bǔ)骨脂、生姜、大棗、生甘草)濃縮液（西安市中醫(yī)醫(yī)院提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)造模：采用目前國(guó)內(nèi)外常用的主動(dòng)免疫造模法，參考許文華等[1]的R97-116復(fù)制 EAMG實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法，第一次免疫：取R97116、CFA、PBS三者充分混勻配制的免疫乳劑200μl（含R97-116：100μg）于大鼠足墊、腹部、背部進(jìn)行皮下注射，取等量PBS液對(duì)正常組進(jìn)行相同處理；第30天及第45天進(jìn)行強(qiáng)化接種免疫，取提前配制的加強(qiáng)免疫乳劑200μl（含R97-116：50μg）進(jìn)行強(qiáng)化免疫，正常組皮下注射等量PBS。

1.3.2 EAMG模型評(píng)估及納入標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)測(cè)量肌力和新斯的明試驗(yàn)來(lái)觀察造模后情況。①測(cè)量肌力（即讓大鼠反復(fù)抓握籠頂30s后再測(cè)量）：采用Lennon評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)予以肌無(wú)力癥狀評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常肌力，無(wú)異常；1分：出現(xiàn)輕度的活動(dòng)減少，大鼠撕咬抓取力量減弱，極易疲勞；2分：大鼠的活動(dòng)較前明顯減少，體重逐漸減輕，身體成拱起的姿勢(shì)，頭和尾出現(xiàn)下垂，雙前肢彎曲，行走不平穩(wěn)伴震顫；3分：大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的全身無(wú)力，抓取、撕咬動(dòng)作消失，身體震顫，臨死表現(xiàn)；4分：大鼠死亡。癥狀介于2個(gè)級(jí)別之間者，可以計(jì)為0.5、1.5、2.5和3.5分。②新斯的明實(shí)驗(yàn)：造模后的大鼠經(jīng)腹腔注射新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），觀察12min后大鼠肌無(wú)力癥狀若能緩解并且持續(xù)2～12h，可以判定為新斯的明試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足Lennon評(píng)分≥1分為肌無(wú)力陽(yáng)性，同時(shí)經(jīng)新斯的明試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性者納入。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥：選取50只健康SPF級(jí)8周齡的雌性Lewis大鼠，隨機(jī)選取8只設(shè)為正常組，剩下的進(jìn)行EAMG造模，將成模的32只EAMG大鼠隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性藥物組，自擬黃芪葛根湯組。根據(jù)動(dòng)物與人藥物劑量的換算公式，按王曉燕教授臨床治療中黃芪常用日劑量180g換算，自擬黃芪葛根湯組給予含黃芪量為16.2mg·kg-1·d-1的自擬黃芪葛根湯灌胃，陽(yáng)性藥物組給予強(qiáng)的松5.4mg·kg-1·d-1灌胃，正常組同模型組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)：治療4周后，①采用Lennon評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估各組大鼠肌無(wú)力癥狀；②禁食12h后采用腹主動(dòng)脈取血法抽取標(biāo)本2ml，于常溫下靜置30min后，以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10min后仔細(xì)提取上部透亮清液，采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中的AChRab、IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 來(lái)表示。符合正態(tài)分布且方差齊性的條件下采用單因素方差分析，否則采用近似穩(wěn)健的方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Lennon評(píng)分比較：見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Lennon評(píng)分比較（±s，分）

表1 各組大鼠Lennon評(píng)分比較（±s，分）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

治療4周后組別 例數(shù) 造模后0.00±0.00 1.87±0.35 0.94±0.32★0.44±0.18★正常組模型組陽(yáng)性藥物組自擬黃芪葛根湯組8 8 8 8 0.00±0.00 1.81±0.46△1.75±0.38△1.81±0.37△

2.2 治療后各組大鼠血清AChRab含量的比較：表2。

表2 治療后各組血清AChRab含量比較（±s）

表2 治療后各組血清AChRab含量比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與自擬黃芪葛根湯組比較，●P＜0.05。

AChRab（ng/ml）組別 例數(shù)0.85±0.10 7.70±0.70△3.81±0.33★●4.69±0.50★正常組模型組陽(yáng)性藥物組自擬黃芪葛根湯組8 8 8 8

2.3 治療后各組大鼠血清IL-6含量比較：見(jiàn)表3。

表3 治療后各組血清中IL-6含量比較（±s）

表3 治療后各組血清中IL-6含量比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與正常組比較，*P＜0.05。

IL-6（pg/ml）42.40±6.82 77.88±7.41△29.74±3.54★*45.21±6.63★●組別正常組模型組陽(yáng)性藥物組自擬黃芪葛根湯組例數(shù)8 8 8 8

3 討論

重癥肌無(wú)力可歸屬于中醫(yī)學(xué)中“痿證”范疇，由內(nèi)傷、外感及多種因素引起。課題組王曉燕教授通過(guò)對(duì)MG患者的長(zhǎng)期觀察，從氣的生理功能進(jìn)行分析認(rèn)為，先天稟賦不足或病后失調(diào)損傷正氣、勞逸過(guò)度、長(zhǎng)期熬夜等因素均可導(dǎo)致腎陽(yáng)不足、元?dú)馓澨?。提出了以“益氣升提，培元固本”的治療原則，選用自擬黃芪葛根湯臨證加減。方中黃芪為君藥，尤擅長(zhǎng)于益脾氣；本方中黃芪重劑使用，文獻(xiàn)研究[2]發(fā)現(xiàn)黃芪一直有大量使用的情況，既補(bǔ)氣又能升氣，從而達(dá)到升陽(yáng)舉陷的效果?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)[3-4]證實(shí)黃芪能夠雙向調(diào)節(jié)紊亂的人體免疫系統(tǒng)；對(duì)干擾素系統(tǒng)有促進(jìn)作用；加速B細(xì)胞成熟和漿細(xì)胞抗體合成，對(duì)T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞具有明顯的免疫增強(qiáng)作用，提高細(xì)胞和體液免疫能力；其所含的多糖類物質(zhì)能夠平衡淋巴細(xì)胞各個(gè)亞群的比例和正常抗體的生成，從而增強(qiáng)其免疫平衡作用。葛根，能夠升陽(yáng)發(fā)表、鼓舞脾胃之氣而達(dá)到生津液、起陰氣、載藥上行的目的，同時(shí)還能夠制約大劑量黃芪的溫燥之性。桂枝、赤芍、茯苓、炒白術(shù)起益氣健脾、調(diào)和脾胃之效；山萸肉味酸性澀，入足厥陰肝經(jīng)，使補(bǔ)中有固；再加之紅參、補(bǔ)骨脂能益氣固腎，腎氣足而陽(yáng)氣旺，腎堅(jiān)固而氣不散。生姜、大棗固護(hù)脾胃、益氣生津；甘草調(diào)和藥性。諸藥合用，能使中焦健運(yùn)而運(yùn)化無(wú)窮，氣機(jī)升降有序而氣血和暢，共奏健脾補(bǔ)中、益氣升提，溫腎中之寒水、榮機(jī)體之四末的功效。