類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎不同中醫(yī)證型外周血Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)研究*

王曉慧 潘文萍 孫素平 王冉悅 張 勝

1 山東中醫(yī)藥大學(xué) 山東 濟(jì)南 250011 2 山東省千佛山醫(yī)院 山東 濟(jì)南 250014 3 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 山東 濟(jì)南 250011

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以侵襲性滑膜炎為特點(diǎn)的一種自身免疫病。Th17細(xì)胞是近幾年被發(fā)現(xiàn)的一種新型T細(xì)胞亞群，Th17/Treg細(xì)胞的失衡對(duì)于RA的發(fā)病至關(guān)重要。本文從Th17/Treg細(xì)胞等細(xì)胞免疫學(xué)角度入手，旨在為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)辨證分型提供更多參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料：RA病人來(lái)自于2016年12月～2017年12月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科住院患者，共117例，男：女比例為1：4.57。濕熱痹阻證54例，占46.15%；寒濕痹阻證14例，占11.97%；痰瘀痹阻證26例，占22.22%，肝腎虧虛證23例，占19.66%。RA患者最小29歲，最大75歲；平均年齡57.61±11.38歲，平均病程9.52±7.96年，四種證型在性別和年齡差異上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。健康對(duì)照組來(lái)于本院查體中心性別和年齡匹配的健康人群，年齡在18～55歲，平均年齡47.90±9.74歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2009年ACR/EULAR對(duì)RA的分類標(biāo)準(zhǔn)[1]，中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[2]辨證分為濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、痰瘀痹阻證、肝腎虧虛證四種證型。由2名中級(jí)職稱以上的醫(yī)師指導(dǎo)辨證分型。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)：①Th17細(xì)胞：抽取納入人員晨起空腹血3～4ml于肝素管內(nèi)，取新鮮抗凝全血200μl于EP管中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基等體積混勻，依次加入新鮮配置的刺激液（PMA工作液50μl，離子霉素工作液20μl，莫能霉素工作液20μl），混勻，打孔，放入37℃，5%CO2孵箱中孵育4小時(shí)。孵育完成后取出混勻，取樣本150μl加入流式細(xì)胞管內(nèi)，加入PE-Cy5-CD4單克隆抗體，室溫避光進(jìn)行細(xì)胞表面染色15min。加入細(xì)胞破膜固定劑避光孵育15min，用PBS溶液洗滌2遍，加入FITC-IFN-γ抗體、PE-IL-17抗體、APC-IL-22抗體避光進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，孵育完成洗滌后制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)上機(jī)檢測(cè)。②Treg細(xì)胞：取新鮮抗凝全血200μl于流式管中，加入FITC-CD4、PE-Cy5-CD25抗體進(jìn)行表面染色，孵育20min后加入破膜固定劑，避光孵育60min，再加入破膜緩沖液，加入APC-Foxp3抗體4°（或室溫）避光孵育30min，孵育完成洗滌后制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)上機(jī)檢測(cè)。③臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：臨床指標(biāo)包括DAS-28（28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)分?jǐn)?shù)）評(píng)分，疼痛VAS評(píng)分（0～100分），關(guān)節(jié)腫脹數(shù)，關(guān)節(jié)壓痛數(shù)；實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括血沉（ESR），C反應(yīng)蛋白（CRP），類風(fēng)濕因子（RF），抗環(huán)瓜氨酸多肽（CCP）抗體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；樣本資料符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況比較：見(jiàn)表1。

表1 兩組Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況比較（±s）

表1 兩組Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況比較（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別RA病人組健康對(duì)照組Th17細(xì)胞（%）2.30±0.75*1.16±0.16例數(shù)117 20 Treg細(xì)胞（%）2.32±0.94*4.01±0.99

2.2 不同證型RA病人Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況：見(jiàn)表2。

表2 不同證型RA病人Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況（±s）

表2 不同證型RA病人Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)情況（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，*P＜0.05。

證型濕熱痹阻證寒濕痹阻證痰瘀痹阻證肝腎虧虛證健康對(duì)照組Th17細(xì)胞（%）2.88±0.66*1.61±0.32*1.92±0.40*1.77±0.23*1.16±0.16 Treg細(xì)胞（%）1.82±0.83*3.25±1.01*2.14±0.39*3.15±0.56*4.01±0.99

2.3 不同證型RA病人DAS28評(píng)分構(gòu)成比情況比較：見(jiàn)表3。

2.4 不同證型RA病人臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分布情況比較：見(jiàn)表4。

表3 不同證型RA病人DAS28評(píng)分構(gòu)成比情況比較[例（%）]

表4 不同證型RA病人臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分布情況比較（±s）

表4 不同證型RA病人臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分布情況比較（±s）

注：與肝腎虧虛證比較，*P＜0.05。

證型濕熱痹阻證寒濕痹阻證痰瘀痹阻證肝腎虧虛證抗CCP抗體455.19±556.03 462.60±360.24 477.20±543.89 443.58±568.42 VAS（100mm）65.28±10.88*61.79±9.12*64.81±7.94*53.26±6.14關(guān)節(jié)腫脹數(shù)（個(gè)）7.09±2.54*3.79±1.58*4.00±2.10*2.35±1.20關(guān)節(jié)壓痛數(shù)（個(gè)）12.26±3.09*9.36±2.37*10.38±2.43*6.83±1.90 ESR（mm/h）62.24±24.86*47.50±27.32*52.15±25.75*25.70±17.39 CRP（mg/L）46.49±34.38*29.76±31.30 27.32±23.86*11.87±13.01 RF（RU/ml）481.95±879.61 229.01±370.63 470.23±639.72 309.39±349.20

3 討論

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。痹證癥狀紛繁復(fù)雜，有時(shí)其外在表現(xiàn)不明顯，這給我們的臨床辨證分型造成了一定的困擾。這就需要一些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)來(lái)輔助中醫(yī)辨證分型，同時(shí)也是為中醫(yī)提供一些客觀化依據(jù)，讓我們更好地選方用藥。Th17細(xì)胞是2005年由Park等[3]提出的一種新的T細(xì)胞亞群，主要分泌白介素-17而不分泌γ-干擾素，可以激活補(bǔ)體，活化中性粒細(xì)胞釋放炎癥性因子，介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)。TH17細(xì)胞參與了RA免疫炎癥反應(yīng)、滑膜增殖、骨侵蝕多個(gè)病理環(huán)節(jié)。本研究中RA患者Th17細(xì)胞表達(dá)在（2.30±0.75）%，明顯高于健康對(duì)照組（1.16±0.16）%。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是由Gershon[4]提出的一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞亞群，可以降低炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，減少抗體分泌，維持自身免疫耐受。在本研究中，RA患者外周血中Th17細(xì)胞明顯升高，Treg細(xì)胞明顯下降，并且這兩者都與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，而且不同證型中兩者的表達(dá)也有顯著差異性。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，濕熱痹阻證和痰瘀痹證中DAS28評(píng)分約有80%以上，而寒濕痹阻證和肝腎虧虛證所占比例較低，而肝腎虧虛證，主要是處于中疾病活動(dòng)度。ESR、CRP等實(shí)驗(yàn)室炎癥指標(biāo)很高，相應(yīng)的兩者Th17表達(dá)也較健康對(duì)照組異常升高，而Treg細(xì)胞卻顯著性降低。兩種證型患者體內(nèi)Th17/Treg嚴(yán)重失衡。相關(guān)性檢驗(yàn)分析提示，證候分型與疾病活動(dòng)度呈現(xiàn)良好相關(guān)性，而與病程不相關(guān)。說(shuō)明在疾病后期，患者雖有正虛之候，但當(dāng)處于疾病炎癥活躍期時(shí)，仍以濕熱和痰瘀為主要證候。在本研究中，活動(dòng)期的RA一部分以濕熱為著，另一部分以痰瘀為著，同時(shí)Th17細(xì)胞也是高表達(dá)，提示我們應(yīng)該以清熱解毒化痰祛瘀為主，選用金銀花、虎杖等一些清熱解毒藥物抑制炎性滲出，同時(shí)兼顧瘀阻經(jīng)絡(luò)，選用赤芍、牡丹皮等一些活血化瘀藥抑制血管翳生成，從而抑制體內(nèi)細(xì)胞因子的致炎作用，增強(qiáng)抗炎作用。此外，病程日久耗傷肝腎，機(jī)體炎癥活動(dòng)下降，應(yīng)以健脾補(bǔ)腎祛寒為主，培補(bǔ)正氣。

由于痹證是一種慢性進(jìn)行性疾病，炎癥因子在體內(nèi)反復(fù)波動(dòng)，耗傷人體正氣，而病久累及肝腎，又反噬筋骨關(guān)節(jié)，形成惡性循環(huán)，故在治療過(guò)程中要辨證審因，注意疾病的客觀化指標(biāo)，綜合運(yùn)用辨病辨證施治。