鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞層形態(tài)觀察及卵泡激素受體表達(dá)研究

余道倫 左瑞華

（皖西學(xué)院，安徽 六安 237012）

鵝是我國飼養(yǎng)量僅次于鴨的水禽，作為一種節(jié)糧型的草食家禽，相較于其他家禽具有抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、耐粗飼等特點(diǎn)。伴隨著生活水平的逐步提高，人們對鵝產(chǎn)品的需求，尤其是對鵝羽絨及其制品的需求正呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢，已呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的局面，因此大力發(fā)展鵝業(yè)生產(chǎn)對農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、促進(jìn)農(nóng)民脫貧致富和提高國民生活品質(zhì)等方面均具有積極而現(xiàn)實(shí)的意義。然而，目前鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展卻十分緩慢，究其原因，主要是受到繁殖力低這一瓶頸的制約，如皖西白鵝，年產(chǎn)蛋僅20—25枚，嚴(yán)重制約了鵝規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。

家禽產(chǎn)蛋性能的高低除了受品種、環(huán)境及飼養(yǎng)管理等因素影響外，更為重要的是取決于卵巢中卵泡的生長和發(fā)育水平。家禽的卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，與哺乳動物不同，禽類的卵泡發(fā)育、成熟的過程具有優(yōu)先等級的特點(diǎn)。原始卵泡經(jīng)過募集開始發(fā)育進(jìn)入等級前卵泡，由小到大經(jīng)小白卵泡（small white follicule，SWF）、大白卵泡（large white follicule，LWF） 而進(jìn)入小黃卵泡庫（small yellow follicule，SYF）。但大量的卵泡中僅5%能經(jīng)過等級發(fā)育進(jìn)入小黃卵泡階段。在產(chǎn)蛋期，每天只有一個SYF被選擇為優(yōu)勢卵泡并進(jìn)入等級發(fā)育，成為排卵前卵泡，之后卵泡按照大小順序發(fā)育，直至排卵，排卵前卵泡按體積由小到大分為F5、F4…F1[2]。被選擇進(jìn)入排卵前卵泡發(fā)育的卵泡數(shù)目越多，家禽的產(chǎn)蛋序列就越長，其產(chǎn)蛋性能越高。因此研究卵泡發(fā)育過程及調(diào)控對于提高家禽產(chǎn)蛋性能意義重大。禽類卵泡的發(fā)育和排卵與卵泡顆粒細(xì)胞的發(fā)育及其表面生殖激素受體的表達(dá)豐度有很大的關(guān)系，卵泡發(fā)育是受內(nèi)外多因素調(diào)控的復(fù)雜生理生化過程[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)生殖軸激素如促卵泡素（follicule stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing horomone，LH）是重要的調(diào)節(jié)因子，它們必須通過顆粒細(xì)胞表面表達(dá)的促卵泡素受體（FSHR）和促黃體素受體（LHR）介導(dǎo)才能作用于卵泡并調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育及排卵[5－6]。

本研究針對顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育、成熟和排卵過程中的重要作用，對卵泡發(fā)育過程中的顆粒細(xì)胞層形態(tài)進(jìn)行觀察研究，同時對表達(dá)于顆粒細(xì)胞上的FSHR和LHR進(jìn)行定量研究，以期為深入研究鵝卵泡的發(fā)育與選擇機(jī)制提供試驗(yàn)性資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

產(chǎn)蛋期皖西白鵝6只，PBS，Trizol試劑，二甲苯，無水乙醇，氯仿，異丙醇，電動研磨器，福爾馬林，伊紅染液，核酸蛋白分析儀，RT-PCR試劑盒，qPCR試劑盒，qPCR儀，光學(xué)顯微鏡（×100），離心機(jī)，渦旋振蕩器，液氮罐，研缽和杵，常規(guī)解剖器材等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取材方法

將鵝處死后剖腹取出整個卵巢，并自卵巢上逐個分離大白、F5、F3和F1卵泡，其中3只鵝分離后的卵泡置于福爾馬林溶液中固定，另3只鵝分離后的卵泡置于PBS溶液去除卵黃后立即投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 石蠟切片制作和H&E染色

福爾馬林固定后的卵泡，經(jīng)脫水、包埋、修塊等步驟后于切片機(jī)上按照5 μm厚度進(jìn)行切片，制作的石蠟切片再經(jīng)37℃烘箱烘烤過夜后即可置于室溫長期保存。

石蠟切片經(jīng)過脫蠟、浸水、染核、分色、藍(lán)化、染質(zhì)、脫水、透明和封片等步驟后即完成H&E染色。

1.2.3 卵泡組織總RNA提?。═rizol法）

從液氮中取出凍存的卵泡組織，放入提前預(yù)冷的研缽中，在液氮作用下快速將其研磨成粉末。稱取10—15 mg卵泡組織粉末于離心管中并加入1 mL Trizol試劑，電動研磨器研磨1 min使組織充分裂解，然后按照組織RNA提取標(biāo)準(zhǔn)程序提取卵泡組織總RNA樣品。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

獲得的總RNA樣品經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測后，樣品吸光度（OD）值A(chǔ)260/280在1.8—2.1區(qū)間，說明總RNA樣品提取質(zhì)量滿足實(shí)驗(yàn)要求。隨后立即將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以鵝GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，對FSHR和LHR基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測，qRT-PCR引物序列如表1所示。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。每個樣品和內(nèi)參cDNA模板設(shè)3個重復(fù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)利用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行 One-way ANOVA分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)均以 means±SE表示。

表1 qRT-PCR引物

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鵝卵泡取樣

鵝是季節(jié)性產(chǎn)蛋家禽，且產(chǎn)蛋具有間歇性，為便于取得鵝連續(xù)的卵泡樣品，本次實(shí)驗(yàn)取材于鵝產(chǎn)蛋高峰期完成，取得的卵巢和卵泡形態(tài)如圖1所示。實(shí)驗(yàn)共取得等級前卵泡SWF、LWF和SYF各若干枚，排卵前卵泡F5，F(xiàn)4…F1各一枚。本研究選擇其中的LWF、F5、F3和F1卵泡作為本次試驗(yàn)的研究對象。

圖1 產(chǎn)蛋期鵝卵巢和卵泡形態(tài)

2.2 鵝等級卵泡顆粒細(xì)胞層形態(tài)觀察與比較

卵泡組織切片經(jīng)H&E染色后，在光學(xué)顯微鏡下100倍油鏡鏡檢，結(jié)果如圖2所示。顆粒細(xì)胞層厚度伴隨卵泡等級發(fā)育自LWF、F5和F3逐漸增加，至F3達(dá)最大厚度，而后在F1突然下降。進(jìn)一步的比較分析顯示F3卵泡顆粒細(xì)胞層厚度顯著高于其他卵泡（P＜0.05）。

圖2 不同等級卵泡顆粒細(xì)胞層厚度及其比較分析（×100）

2.3 等級卵泡顆粒細(xì)胞表面FSHR mRNA表達(dá)水平

等級卵泡顆粒細(xì)胞FSHR基因擴(kuò)增情況如圖3所示。由圖3A可見溶解曲線目的基因和內(nèi)參基因GAPDH都僅出現(xiàn)單一的溶解峰，無其他雜峰出現(xiàn)，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物是可行的。由圖3（B）可見FSHR表達(dá)從LWF緩慢上升至F3，而在F1卵泡階段突然下降。FSHR表達(dá)總體呈現(xiàn)的是先緩慢增加而后突然下降的趨勢。

圖3 目的基因FSHR mRNA在不同等級卵泡的qRT-PCR檢測結(jié)果

2.4 等級卵泡顆粒細(xì)胞表面LHR mRNA表達(dá)水平

等級前和排卵前卵泡LHR基因擴(kuò)增情況如圖4所示。由圖4A可見溶解曲線目的基因和內(nèi)參基因都僅出現(xiàn)單一的溶解峰，無其他雜峰出現(xiàn)，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物是可行的。由圖4（B）可見LHR基因表達(dá)在整個等級卵泡階段呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。

圖4 目的基因LHR mRNA在不同等級卵泡的qRT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

3.1 采樣時間對連續(xù)卵泡樣品獲取的影響

鵝屬季節(jié)性產(chǎn)蛋家禽，根據(jù)鵝的產(chǎn)蛋生理以及鵝卵泡等級發(fā)育的特點(diǎn)，本次實(shí)驗(yàn)鵝的取卵時間在鵝開產(chǎn)2個月后進(jìn)行，此時鵝正處于產(chǎn)蛋高峰期。母鵝在繁殖周期中的產(chǎn)蛋期、就巢期以及休產(chǎn)期其體內(nèi)卵泡的發(fā)育形態(tài)和數(shù)量差異較大，不同發(fā)育階段的卵泡會發(fā)生卵泡閉鎖或萎縮，卵泡發(fā)育停止和退化等生理現(xiàn)象。開產(chǎn)期母鵝卵巢上的等級卵泡生長發(fā)育活躍，卵巢腹側(cè)面出現(xiàn)大量等級前卵泡和部分排卵前卵泡，層次分明，沒有閉鎖卵泡。產(chǎn)蛋高峰期母鵝卵巢表面可觀察到大量的等級前卵泡和連續(xù)的排卵前卵泡，而原始卵泡呈靜止?fàn)顟B(tài)[7]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，產(chǎn)蛋高峰期鵝卵巢上存在連續(xù)的卵泡序列，這一結(jié)果為開展鵝卵泡發(fā)育研究時進(jìn)行卵泡樣品采集提供了試驗(yàn)依據(jù)。

3.2 顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)變化

顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的相互作用是卵泡發(fā)育、成熟并成功排卵的內(nèi)在機(jī)制[8]。本研究通過制作鵝等級卵泡的石蠟切片并對其進(jìn)行觀察，對顆粒細(xì)胞的形態(tài)特征進(jìn)行了初步研究。形態(tài)觀察結(jié)果表明：隨著等級卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞層發(fā)生了顯著變化，隨卵泡直徑的增加顆粒細(xì)胞層厚度呈現(xiàn)先增加后下降的態(tài)勢。這一結(jié)果暗示了顆粒細(xì)胞層厚度在卵泡發(fā)育前期逐漸增厚可能是為了將卵母細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)固定或逐步增強(qiáng)顆粒細(xì)胞調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育能力而進(jìn)行的組織形態(tài)適應(yīng)過程，而在進(jìn)入臨近排卵前階段厚度又逐漸下降，這可能是為卵母細(xì)胞破卵而出創(chuàng)造適宜的條件。本研究中鵝卵泡顆粒細(xì)胞層厚度在F3卵泡達(dá)最大厚度，這一結(jié)果與慈光新等對雞的等級卵泡顆粒細(xì)胞層進(jìn)行觀察的結(jié)果一致[6]，說明卵泡顆粒細(xì)胞層隨卵泡等級發(fā)育的變化在鵝與雞上具有一定的相似性。此外，伴隨卵泡的等級發(fā)育，顆粒細(xì)胞層厚度逐漸增加，并在排卵前F3卵泡達(dá)最大厚度，隨后又在F1卵泡突然下降，據(jù)此，我們推測這可能是顆粒細(xì)胞在功能上為適應(yīng)排卵需要而在形態(tài)上做出的主動性變化，其內(nèi)在機(jī)理仍需進(jìn)一步深入研究和探討。本研究結(jié)果為今后深入研究顆粒細(xì)胞發(fā)育奠定了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

3.3 FSHR和LHR mRNA在卵泡等級發(fā)育中的表達(dá)變化

卵泡的發(fā)育成熟并排卵是在體內(nèi)多種激素的共同調(diào)控下完成的，垂體釋放的促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是這些激素的代表，它們通過與顆粒細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合進(jìn)而調(diào)控卵泡的等級發(fā)育過程，并最終促使卵泡成熟并排出體外[5-6，9]。FSHR和LHR是卵泡顆粒細(xì)胞上表達(dá)的垂體促性腺激素受體，其表達(dá)變化與卵泡發(fā)育成熟并排卵具有密切的內(nèi)在聯(lián)系[10－11]。本實(shí)驗(yàn)以顆粒細(xì)胞為研究對象，探討了FSHR和LHR兩種激素受體在鵝不同等級卵泡的表達(dá)情況。結(jié)果表明伴隨卵泡逐漸成熟FSHR mRNA表達(dá)量在F3卵泡達(dá)到最高峰，而在F1卵泡突降至最低，而LHR mRNA在卵泡發(fā)育中一直處于上升態(tài)勢，尤其是在排卵前卵泡階段，上升幅度更為明顯，這些結(jié)果與董霞等的研究結(jié)果一致[12]。另有其他研究表明，F(xiàn)SH可以促進(jìn)未成熟卵泡快速發(fā)育，LH可以促進(jìn)成熟卵泡排卵，在卵泡發(fā)育至排卵前卵泡階段，卵泡逐漸由FSHR依賴逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)長HR依賴，為即將到來的排卵做準(zhǔn)備[13－14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中FSHR在F1突降以及LHR在排卵前卵泡一直處于上升趨勢，這些充分說明卵泡顆粒細(xì)胞為適應(yīng)排卵需要可以在功能上做出主動性變化，以實(shí)現(xiàn)禽類的順利排卵。雖然目前僅就FSHR和LHR在顆粒細(xì)胞的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，尚不能在機(jī)制上詮釋顆粒細(xì)胞發(fā)育對卵泡成熟和排卵的具體作用，但是本研究結(jié)論為今后開展鵝卵泡等級發(fā)育以及相關(guān)產(chǎn)蛋生理研究積累了一定的參考性資料，對于FSHR和LHR是否與其他相關(guān)因子共同作用影響卵泡的發(fā)育在本實(shí)驗(yàn)中未有涉及，還有待進(jìn)一步深入研究和探討。

4 結(jié)語

綜上所述，本文針對鵝產(chǎn)蛋期卵泡的發(fā)育形態(tài)以及與卵泡發(fā)育和排卵密切相關(guān)的激素受體表達(dá)開展了初步研究。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，鵝卵泡發(fā)育呈現(xiàn)連續(xù)的等級發(fā)育過程。通過進(jìn)一步的分析我們推測顆粒細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)是鵝卵泡正常發(fā)育的內(nèi)在動力，同時伴隨卵泡發(fā)育過程其表面激素受體表達(dá)水平亦發(fā)生相應(yīng)變化，這些因素的共同作用促進(jìn)了卵泡的連續(xù)發(fā)育以及成熟卵泡的順利排卵?？傊狙芯拷Y(jié)果為今后深入開展鵝卵泡的等級發(fā)育機(jī)制積累了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。