細(xì)胞重組的轉(zhuǎn)化應(yīng)用

◎ 斯坦福大學(xué)干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)副教授 馬里厄斯.韋尼格

在很久之前,我們知道細(xì)胞發(fā)展被稱為是單向的，像胚胎大部分的發(fā)展要成熟，由胚胎細(xì)胞分化為不同類型的細(xì)胞，最后在我們成人體內(nèi)可以看到細(xì)胞不斷成熟。但是都認(rèn)為細(xì)胞分化是單向的，但是由于不同的編碼編程以及不同的組合的經(jīng)驗(yàn)，可以把一個完全成熟的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，回到它的原始狀態(tài)，這就是我們首先要分享的內(nèi)容，我們所說的細(xì)胞和它的研究。

之前也有克隆的研究，東京大學(xué)的教授認(rèn)為一些轉(zhuǎn)錄的因素可以幫助我們把細(xì)胞轉(zhuǎn)化為和胚胎干細(xì)胞非常類似的細(xì)胞。因此我們就在想，這種直線性的發(fā)展，我們要考慮到這些細(xì)胞之間的關(guān)系，或者說我們把一個非常成熟的狀態(tài)的細(xì)胞，假如說成人細(xì)胞如何把它回歸到原始的胚胎細(xì)胞的狀態(tài)，這是非常精彩的現(xiàn)象。如何把一個成熟的成人細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為原始的狀態(tài)，如何把纖維元細(xì)胞變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞？我們認(rèn)為，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞是從纖維元細(xì)胞中獲得的，直接變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞。

設(shè)想如何從病人身上找到一些樣本？我們把這些細(xì)胞進(jìn)行重組，從IPS可以把它們直接進(jìn)行組合，利用這些細(xì)胞實(shí)現(xiàn)葡萄糖的運(yùn)輸。帕金森癥的一些患者主動加入了我們的研究，我們希望能夠了解人類的基因工作機(jī)理以及基因如何突變的，如何會導(dǎo)致這些老年癡呆癥以及帕金森癥。

我們思考這個問題從何而來？這是一個非常積極的項(xiàng)目。我們希望能夠進(jìn)一步的思考，找到這種結(jié)果。如何能夠?qū)崿F(xiàn)這種轉(zhuǎn)換，從一個不同的細(xì)胞類型、纖維元細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細(xì)胞，他們本來沒有什么關(guān)系，這個轉(zhuǎn)錄的因素叫做Ascl1，這是一個非?；镜霓D(zhuǎn)換，從Helix可以找到它的轉(zhuǎn)錄因素。這些因素一般來說是可以把不同的鏈整合在一起。我們要問的第一個問題是：Ascl1在纖維元細(xì)胞組中處在哪個位置，纖維元細(xì)胞一旦呈現(xiàn)出來的時候，我們希望找到它的基因組，它的基因阻在哪個部分，基因組中SCRE在哪個地方呢？我們可以看到這個基因組在這里有一個熱圖，我們利用IP序列的方式找到他的熱圖，在MEFs以及BAM方面它的特征跟NPCs是一樣的，也就是說這些基因的目標(biāo)是非常開放的，是在纖維元細(xì)胞當(dāng)中可以找到的，或者說我們可以找到Ascl1，纖維元細(xì)胞里面可以找到相似的細(xì)胞組行，這是它的轉(zhuǎn)錄里面非常相似的類型，就是它的這種染色質(zhì)是如何整合在一起的。為了把他們區(qū)分他們是開放的，讓你可以找到這些基因序列。到底我們怎么樣能夠在這個過程中進(jìn)行分別，尤其是在表達(dá)之前可以進(jìn)行區(qū)分。首先是經(jīng)過處理，還有再目標(biāo)的基因分子。看這周圍兩者相聚比較近，這是科學(xué)上的表述。也就是說他們的DNA在核附近，做這個附近意味著他們沒有辦法轉(zhuǎn)錄，是封閉的，這是非常重要的一點(diǎn)。只有一部分的轉(zhuǎn)錄因子是存在，也知道他們可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，他們被稱之為先鋒因子。所以我們知道Ascl1指的是有相應(yīng)的靶向先鋒因子的。

在目標(biāo)方面，可以看出有一些差異的存在，一旦表達(dá)了出來，就可以開放性的表達(dá)，這個區(qū)域?qū)ζ渌D(zhuǎn)錄的區(qū)域是開放，對于其他染色質(zhì)的建模都成為了可能性，我們希望通過這種方式更好地了解，并且衡量實(shí)際所發(fā)生的狀況。為了能夠做到這一點(diǎn)，把我們的方法進(jìn)行了一定的優(yōu)化。我們的方法叫做ATAC-seq，把這個染色質(zhì)開放又關(guān)閉，這個開放可以了解整個發(fā)展進(jìn)程的變化?；蛘呤菑腄NA的階段出現(xiàn)。這里藍(lán)色所展示就是我們這個TM-5，其實(shí)是我們秩序的指引物，而我們的Chromatin一旦進(jìn)入核的區(qū)域就沒有辦法進(jìn)行融合了。我們把這個方法應(yīng)用到一系列的重要的結(jié)合點(diǎn)，這個結(jié)合點(diǎn)也顯示出染色質(zhì)動態(tài)的變化。在圖中黑色的曲線所代表的區(qū)域，如果出現(xiàn)了lttTA是有基本的信號，但是如果說我們在經(jīng)過了12個小時之后，我們的這個信號就會極大的提升，而且是非常明顯的，而且是開放式的，大家可以在圖中看到這個信號不斷增加，在整個轉(zhuǎn)錄過程中這個信號是在快速增加的。紅色是不同的效率，離染色質(zhì)比較近。在這一塊經(jīng)過五天之后，明顯可以發(fā)現(xiàn)這個數(shù)值的變化還是比較大的。也就是說，在兩邊有兩個核的區(qū)域。這個核的區(qū)域正好就在中心的兩邊。因此，一個單一轉(zhuǎn)錄的區(qū)域是如此的漂亮，他們有著直接的靶向區(qū)域，從一開始的時候是更加隨機(jī)的分配的模型，接著逐漸轉(zhuǎn)化到了更加高結(jié)構(gòu)化的架構(gòu)，在這里給大家展示的數(shù)據(jù)也有類似的觀點(diǎn)。

基于顏色密度不同，可以看到這個顏色之間出現(xiàn)的分辨率的情況，在這里我不想浪費(fèi)大家的時間沒有辦法講特別細(xì)，但是我想讓大家可以看一下，這兩張圖其實(shí)是有所不同的。因?yàn)樵谶@里有兩朵云，第二朵云這兩邊就更平一些，這就是我們所謂的第二個細(xì)胞核的層，而且跟第一層會有著一定的重疊。

剛才給大家展示了都是一些其他的數(shù)據(jù)，這都是從靶向、目標(biāo)的角度來思考的。基因?qū)W當(dāng)中可以分析，如果改變基因其他方面會帶來怎樣的影響？對于所有基因科學(xué)家來說，因?yàn)槲覀兊幕騾f(xié)會是面向開放的，我們就能夠看到有很多的變化已經(jīng)出現(xiàn)了。最上面的區(qū)域密度是比較大，還有一些平均密度比較高的區(qū)域正在關(guān)閉，而其他的區(qū)域卻并非如此。這其實(shí)是因?yàn)槲覀兗せ盍怂霓D(zhuǎn)錄因子，我們到底應(yīng)該怎么樣決定什么時候應(yīng)該關(guān)閉，最重要的是我們可以看一下目前沒有非常明確的機(jī)制，我們必須依靠內(nèi)部的方法和工具，包括一些通用的效果和方法來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

我們發(fā)現(xiàn)的另外一個驚奇是，做調(diào)查的時候可以看到對不同的情況，從0到220，在這個過程中可以看到隨著地點(diǎn)的放開，這些變化不是漸進(jìn)式的，這里實(shí)現(xiàn)的是兩天到五天時間非常性的提升。我們的整個轉(zhuǎn)錄過程其實(shí)也是逐漸所產(chǎn)生的。而且，是需要我們進(jìn)行緩慢的安排。在此過程中出現(xiàn)了非常快速、明顯的轉(zhuǎn)化，就像我們在建模一樣的。這些調(diào)整是對序列的調(diào)整。

第二天和第五天的時候，是在逐漸的成熟化的轉(zhuǎn)換過程中。比如說在第二天的時間軸，在我們通過控制、對照的過程來進(jìn)行一些區(qū)分，到第五天產(chǎn)生了更加巨大的變化。從細(xì)胞生物學(xué)的角度來看，大部分的變化都是后期產(chǎn)生的，都是需要有相應(yīng)的設(shè)計，我們在一開始的時候不需要期待有太多的變化，但是實(shí)際上在最后我們的變化是逐漸累計而成的。很遺憾沒有特別多的時間給大家介紹另外一個轉(zhuǎn)錄的流程，這個轉(zhuǎn)錄的流程就只能給大家稍微做一些簡要介紹了。

我想跟大家介紹一下我們當(dāng)前所做的工作和研究。這個研究我們把它叫做Myt1l。通過我們神經(jīng)元的流程有一個過程，這個過程是對非神經(jīng)元程序的抑制，我們發(fā)現(xiàn)它們通過配合能夠形成更好的效果，它們可以更加有效地開發(fā)并且關(guān)閉神經(jīng)元的程序，也有相應(yīng)神經(jīng)元負(fù)責(zé)不同的基因。比如說對部分神經(jīng)元的編輯。跟大家強(qiáng)調(diào)一下，我們當(dāng)前所看到的一些主要結(jié)論：

IPS細(xì)胞是如何運(yùn)作的？大家比較熟悉，有各種不同的類型。為了強(qiáng)調(diào)它們之間的差別，我想跟大家談一下最近所發(fā)布的一些資料當(dāng)中設(shè)計出來的信息，可以看到這兩者之間的機(jī)理是有多大的差異。這里主要是有四類不同的程序，從左往右，首先是MES，第二個是經(jīng)過48小時，第三是經(jīng)過預(yù)先的處理的方式，最后是ESC的方式。給大家展示的是，如果EVs增加，那么這個增加就要求我們進(jìn)行一些更加詳細(xì)的分析，有沒有出現(xiàn)一些特定的表達(dá)，如果說它確實(shí)快速地關(guān)閉了我們所需要的類型，而且這個程序本身是需要能夠得到表達(dá)的。

接下來考慮整個刺激的變化，確實(shí)會有一些變化的發(fā)生，有一些是技術(shù)上很好的，可以測量和評估的，包括對于阻蛋白調(diào)節(jié)的變化，這些變化需要很長的時間累計，才能產(chǎn)生明顯的效果。

轉(zhuǎn)錄因子去哪里了？我們有一些提升的因素，這些因素當(dāng)然受了一些主要的推動因素的影響，比如說βB，這一塊我們可以看到這個轉(zhuǎn)錄因子失去了它兼容性，沒有辦法更加明顯地表現(xiàn)出來。如果說我們現(xiàn)在去問到底影響整個的編碼因素是什么？我們通過觀察發(fā)現(xiàn)，這些再次編輯作用不是在初期所出現(xiàn)的，而是有不同的變化呈現(xiàn)，是有結(jié)合的，最后得出來的結(jié)論是即使說它可以引起轉(zhuǎn)錄因子的變化，正是這樣的因素關(guān)閉了刺激的因素。這就花了非常長的時間，專門用相當(dāng)?shù)木M(jìn)一步探索到底是由哪些因素起到的作用。我們的這種轉(zhuǎn)錄因素可以找到合適的目標(biāo)，而且在這樣的纖維元細(xì)胞里面可以明確想要找到具體的基因序列是哪個。

我想進(jìn)一步地闡述這種機(jī)理的原理。我們可以看到這種基因的序列的研究?？梢詭矸浅Ｓ腥さ挠^察，調(diào)整出其中一個比較有趣的結(jié)論跟大家分享一下。

這里有100-120個左右的細(xì)胞，從纖維元細(xì)胞到神經(jīng)元細(xì)胞，基于它的基因表達(dá)相似之處，發(fā)現(xiàn)這個基因里面有這個曲線，這就是一個重組的路徑，另外兩個比較有趣的現(xiàn)象發(fā)生在這個重組路徑中，這些細(xì)胞他們之前所說誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞到神經(jīng)元細(xì)胞的過程，跟原始路徑是截然不一樣的，而且也是呈現(xiàn)出一種向下的曲線。這個五個細(xì)胞不能從下降的曲線、下降的轉(zhuǎn)錄因素里面找到。這里我們所說的Ascl1，這幾個細(xì)胞形成一個大的群體，很多細(xì)胞通過誘導(dǎo)產(chǎn)生，可以用于我們的分析。因此，Ascl1這些細(xì)胞他們可以產(chǎn)生出非常密集的趨勢，這些細(xì)胞可以非常有選擇性的進(jìn)行表達(dá)，而且它們呈現(xiàn)出比較統(tǒng)一的表達(dá)類型。為了增強(qiáng)這一點(diǎn)我們也是在這個區(qū)域來分析纖維元細(xì)胞和神經(jīng)元的對比。可以發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞是在原始項(xiàng)目里面誘導(dǎo)出來，某種情況下它們的細(xì)胞越來越多，Ascl1是一個比較啟動的因子，可以讓我們了解這樣一個基因序列的作用，可以作為一種轉(zhuǎn)錄的啟動因素，因此我們就會思考Ascl1是否有一些深入化學(xué)的特性和肌肉有關(guān)、和神經(jīng)元有關(guān)，在我們的研究過程中在我們的項(xiàng)目里面其實(shí)沒有發(fā)現(xiàn)這些具體的信息，對于這樣一個體我們需要進(jìn)行不同研究。思考一下MyoD和Ascl1的特點(diǎn)，在神經(jīng)細(xì)胞里面把MyoD放到其中，他們有相似的地方。Ascl1可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞，MyoD1可以誘導(dǎo)肌肉細(xì)胞，這張圖中可以顯示出結(jié)果。另外，在這個項(xiàng)目里面還可以發(fā)現(xiàn)這些Ascl1有關(guān)的序列是被激活的，我們把這樣的兩個轉(zhuǎn)錄因素進(jìn)行具體的描述，在纖維元細(xì)胞中如何進(jìn)行爭取的。我們來研究Ascl1和MyoD這些轉(zhuǎn)錄因素的相似之處。在這些項(xiàng)目中它們有相同的整合方式，盡管說這種整合方式比較相似，這個轉(zhuǎn)錄根本上來說是截然不一樣的。因?yàn)樗墓δ苄允窍喾吹?，從神?jīng)元到纖維元細(xì)胞到肌肉細(xì)胞有不同的過程。

它們這種轉(zhuǎn)錄功能是不一樣的通過一定的數(shù)據(jù)分析之后，我們需要看一下它的這種整合類型的數(shù)量，從數(shù)量方面進(jìn)行考量。通常我們把這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分層、進(jìn)行分類，并分析它們結(jié)合的強(qiáng)度。Ascl1有很強(qiáng)的整合效果，而從數(shù)量角度來看MyoD的整合方式是比較強(qiáng)的。另外，還有一種方式來評估它的基因序列，可以看出Ascl1以及MyoD基因表達(dá)的相關(guān)性。這可以幫助我們解開問題的答案。像我們之前所說的，Ascl1是和神經(jīng)元細(xì)胞以及肌肉細(xì)胞有關(guān)，從MyoD的角度進(jìn)行考量。我們可以看一下它的這種肌肉細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的關(guān)系，它的表達(dá)性可能說不像MyoD表達(dá)性那么強(qiáng)，那么因此如何實(shí)現(xiàn)一種平衡，能夠把MyoD和Ascl1之間的基因表達(dá)進(jìn)行平衡，能夠把這些神經(jīng)元進(jìn)行啟動。有一種抑制劑，可以抑制這種肌肉細(xì)胞，如果把MyoD和Ascl1進(jìn)行抑制的話形成這樣一個結(jié)果，MyoD有一個非常強(qiáng)的肌肉細(xì)胞表達(dá)。