蘆婷婷，田欣，王競

(1 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001；2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院)

乳腺癌根據(jù)受體類型不同分為3種，即激素受體陽性、HER2陽性及三陰性，其中三陰性乳腺癌發(fā)病率最低?；熓侨幮匀橄侔┑闹饕委煼椒?，但患者預(yù)后較差[1,2]。法卡林二醇(FAD)是一種從植物中提取的天然物質(zhì)，具有抗炎、抗菌等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[3,4]，其優(yōu)勢是可以在安全用量范圍內(nèi)殺死腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞死亡[5～8]。2012年1月～2016年9月，我們對乳腺癌細(xì)胞給予FAD單藥或聯(lián)合用藥處理，旨在探討FAD對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468，正常乳腺細(xì)胞MCF-10，均購自美國ATCC。FAD購自上海皓元醫(yī)藥股份有限公司。MTT試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；5-氟尿嘧啶(5-Fu)、硼替佐米(BRZ)，美國Sigma公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

2 方法與結(jié)果

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細(xì)胞、MDA-MB-468細(xì)胞、MCF-10細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5天傳代1次。

2.3 FAD對細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期3種細(xì)胞，每種細(xì)胞分為5組，分別加入0、3、 6、12、24 μmol/L FAD作用24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。結(jié)果顯示，兩種乳腺癌細(xì)胞在0、3、6、12 μmol/L FAD作用下細(xì)胞增殖率逐漸降低(P均<0.05)；24 μmol/L FAD作用下細(xì)胞增殖率低于0、3、6 μmol/L FAD(P均<0.05)，但與12 μmol/L FAD作用下比較P>0.05。正常乳腺細(xì)胞在各濃度FAD作用下細(xì)胞增殖率比較P均>0.05。見表1?？紤]到干預(yù)效果及節(jié)省試劑的原則，我們選擇3 μmol/L FAD進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同濃度FAD作用下三種細(xì)胞增殖率

2.4 FAD對細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期3種細(xì)胞，每種細(xì)胞分為FAD組和對照組，F(xiàn)AD組加入含3 μmol/L FAD的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)) ×100%。結(jié)果顯示，兩種乳腺癌細(xì)胞的FAD組細(xì)胞凋亡率均高于其對照組(P均<0.01)，MCF-10A細(xì)胞的FAD組細(xì)胞凋亡率與其對照組比較P> 0.05。 見表2。

表2 兩組細(xì)胞凋亡率比較

2.5 FAD與其他藥物聯(lián)合作用對細(xì)胞凋亡率的影響 選擇乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第一組實(shí)驗(yàn)：將MDA-MB-231細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、5-Fu組、FAD組、5-Fu+FAD組?？瞻捉M常規(guī)培養(yǎng)，5-Fu組加入含25 μmol/L 5-Fu的培養(yǎng)基培養(yǎng)，F(xiàn)AD組加入含1 μmol/L FAD的培養(yǎng)基培養(yǎng)，5-Fu+FAD組加入含25 μmol/L 5-Fu及1 μmol/L FAD的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞凋亡率為(3.50±0.26)%、5-Fu組為(10.43±0.15)%、FAD組為(20.43±0.12)%、5-Fu+FAD組為(50.63±0.25)%，5-Fu組、FAD組、5-Fu+FAD組均高于空白組(P均<0.01)，5-Fu+FAD組高于5-Fu組和FAD組(P均<0.01)，而5-Fu組與FAD組比較P>0.05。第二組實(shí)驗(yàn)：將MDA-MB-231細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、BRZ組、FAD組、BRZ+FAD組?？瞻捉M常規(guī)培養(yǎng)，5-Fu組加入含25 μmol/L 5-Fu的培養(yǎng)基培養(yǎng)，BRZ組加入含10 nmol/L BRZ的培養(yǎng)基培養(yǎng)，BRZ+FAD組加入含10 nmol/L BRZ及1 μmol/L FAD的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞凋亡率為(3.30±0.20)%、BRZ組為(40.40±0.26)%、FAD組為(20.63±0.23)%、BRZ+FAD組為(85.4±0.26)%，BRZ組、FAD組、BRZ+FAD組均高于空白組(P均<0.01)，BRZ+FAD高于5-Fu組和FAD組(P均<0.01)，而5-Fu組與FAD組比較P>0.05。

3 討論

研究證實(shí)，F(xiàn)AD的作用機(jī)制與細(xì)胞自噬有關(guān)[9]。FAD可抑制蛋白酶體的功能，誘導(dǎo)蛋白累積，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)而發(fā)揮殺傷并抑制腸癌細(xì)胞增殖的作用[10]。本研究觀察了FAD對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著FAD濃度升高，其對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)，且3～12 μmol/L時(shí)效果最佳；但其對正常乳腺細(xì)胞并無殺傷作用。提示FAD可用于治療乳腺癌，且對正常乳腺細(xì)胞影響小，藥物毒副作用可能較低。

5-Fu是治療惡性腫瘤的一線藥物，主要藥理作用是通過干擾DNA合成誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。5-Fu目前廣泛用于胃腸、頭頸部、胸部、卵巢等部位腫瘤治療，但其胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)及肝腎功能損害等毒副作用大，患者耐受性較低[11]。BRZ可通過泛素-蛋白酶體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，與化療及放療聯(lián)合可發(fā)揮協(xié)同抗癌作用[12]。本研究分別將FAD與5-Fu或BRZ聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥可提高FAD促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且FAD用藥劑量降低，僅1 μmol/L；提示FAD可與5-Fu、BRZ等抗腫瘤藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)壓力高，需要更多的壓力支持通路才能得以生存，因此更易受到超負(fù)荷的影響[13]。協(xié)同作用就是通過應(yīng)力的致敏及過載提高殺傷作用。這可能是FAD與5-Fu或BRZ協(xié)同作用的原理。此外，F(xiàn)AD與5-Fu還能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及DNA合成障礙[14,15]，而BRZ可通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，這些也可能是FAD與5-Fu、BRZ聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用的原因。

綜上所述，F(xiàn)AD可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，但不影響正常乳腺細(xì)胞；FAD聯(lián)合5-Fu或BRZ對促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的效果優(yōu)于FAD單藥。