高脂飼料中添加綠原酸對草魚生長性能和脂質(zhì)代謝的影響

楊天俊 陳彥良 劉文舒 郭小澤 唐艷強 劉玉廷 黎徳兵 李思明*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院，南昌 330200;2.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130)

魚類因消化道較短，消化酶活力低，對飼料蛋白質(zhì)利用率低[1]，易導致水體氨氮含量過高，制約魚類生長和引發(fā)魚類疾病。為降低水體環(huán)境中的氮磷含量，預防魚類爆發(fā)疾病，實際養(yǎng)殖過程中在保證飼料營養(yǎng)均衡的條件下，普遍采取減少飼料蛋白質(zhì)水平和適量提高脂肪水平的策略[2]，這種養(yǎng)殖策略可達到促進魚體生長、保護養(yǎng)殖水域的目的[3]。正常情況下，草魚飼料脂肪需求水平為3%～6%[4]，當飼料脂肪水平過高時易致使魚體脂肪蓄積過量，肝胰臟等組織受到損傷，反而導致魚體生長緩慢，飼料系數(shù)上升[5-8]，養(yǎng)殖效益下降。

草魚攝食量大，對高脂飼料利用能力低，攝食高脂飼料極易使魚體脂肪沉積過多，機體脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂[9]。有報道指出，忍冬屬或杜仲屬中草藥植物中提取的綠原酸(chlorogenic acid，CGA)具有抗菌、消炎、抗氧化的特性[10-12]。亦有大量研究報道CGA具有促生長，降脂糖等效用[13-15]。CGA作為飼料添加劑對凡納濱對蝦生長性能[16]及對草魚肌肉品質(zhì)的影響[17]已有文獻報道，但CGA對魚類脂質(zhì)代謝的研究尚未見報道。為此，本試驗擬在高脂飼料(粗脂肪含量約為9.00%)中添加不同水平CGA，研究CGA對草魚生長性能和脂質(zhì)代謝的影響，旨在探索解決由高脂飼料引起魚脂肪蓄積過多而致魚體生長緩慢、脂質(zhì)代謝紊亂等問題，為CGA應用于草魚等水生動物養(yǎng)殖和開發(fā)新型水產(chǎn)添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

由于草魚脂肪需要水平范圍為3%～6%，本試驗設計飼料中豆油添加水平為8%(飼料粗脂肪含量約為9.00%)。CGA(購自Sigma公司，純度≥95%)添加水平參考張純[18]、王蕓等[19]對建鯉、凡納濱對蝦的研究報道，分別在基礎飼料中添加0(C)、200(200CGA)、400(400CGA)、600 mg/kg CGA(600CGA)，以微晶纖維素為填充物調(diào)節(jié)各飼料總量一致。飼料原料粉碎后經(jīng)60目篩篩出粉料，過篩粉料逐級混勻，豆油在所有粉料混勻之后添加，待豆油混勻之后，加入適量蒸餾水拌勻，以小型制粒機制作直徑為1～2 mm的粒狀飼料，制備的飼料顆粒于陰涼干燥處配合風扇風干48 h，然后密封于自封袋中，-20 ℃條件下貯存?zhèn)溆?。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1)每千克維生素預混料含有 Contained the following per kg of the vitamin premix:VA 350 000 IU,VD3450 000 IU,VE 20 g,VK37.5 g，VB110 g，VB210 g，VB612 g，VB1220 mg，煙酰胺nicotinamide 40 mg，葉酸folic acid 3 g，泛酸鈣calcium pantothenate 30 g，生物素biotin 100 mg，VC 60 g，肌醇inositol 60 g。
2)每千克礦物質(zhì)預混料含有 Contained the following per kg of the mineral premix：NaH2PO4100 g，KH2PO4215 g，Ca(H2PO4)2·2H2O 265 g，CaCO3105 g，乳酸鈣 Ca-lactate 165 g，MgSO4·7H2O 100 g，AlCl3·2H2O 12 g，ZnSO4·7H2O 5.11 g，檸檬酸鐵 Fe-citrate 0.61 g，MnSO4·4H2O 1.43 g，KI 0.58 g，CuCl20.51 g，CoCl2·6H2O 1.76 g，KCl 28 g。

1.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理

試驗所用草魚由江西省水產(chǎn)研究所提供，魚苗運抵江西省農(nóng)科院畜牧研究所經(jīng)高錳酸鉀消毒及水溫適應后放養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，該系統(tǒng)含20個直徑100 cm，高80 cm的圓形養(yǎng)殖桶，可進行水溫控制，養(yǎng)殖用水氨氮含量小于0.05 mg/L，pH為7.5左右，溶氧含量大于5 mg/L。養(yǎng)殖過程中24 h曝氣增氧，預試期10 d，之后選取活力強體質(zhì)優(yōu)大小為(7.53±0.30) g草魚360尾，隨機分為4組，分別飼喂1種上述試驗飼料，每組3重復，每重復30尾，每個重復的30尾放養(yǎng)于1個養(yǎng)殖桶。每日09:00和16:00按分組進行投喂，日投喂量為草魚體重的5%～7%，每周換水以及虹吸排污2～3次，每次換水約為養(yǎng)殖桶水體總量的1/3。正試期于2016年8月24日開始，2016年11月8日結束，為期11周。

1.3 樣本采集

正試期結束前24 h停止投喂，對整池的草魚進行稱重計數(shù)，每組魚隨機選取18尾(每重復6尾)進行體長、體寬的測量，置于解剖盤中完整取其內(nèi)臟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈，經(jīng)由濾紙吸干后稱重。再每組隨機抽取6尾魚進行全魚的常規(guī)營養(yǎng)成分測定，所抽取的全魚樣本整理編號后貯存于-80 ℃中保存待測。

每組魚隨機取18尾(每重復6尾)試驗魚，麻醉后用量程為1或2 mL的一次性注射器進行尾部靜脈采血，于4 ℃條件下自然凝固，過夜，冷凍離心機3 500 r/min離心15 min，采集血清置于-20 ℃中保存待測，草魚血液采集完畢后置于解剖盤中，打開腹腔，完整取出內(nèi)臟，分離出肝胰臟并用PBS洗凈，濾紙除去表面水分，于-80 ℃環(huán)境下貯存待測。

1.4 制備肝胰臟勻漿液

肝胰臟勻漿液的制備：保存于-80 ℃條件下的肝胰臟樣本逐級解凍(-20、4 ℃)后[20]，取出肝胰臟樣本并精確稱重，在量程為20 mL的玻璃勻漿器中按照肝胰臟重量精準地加入9倍體積溫度為4 ℃的0.68%生理鹽水，冰浴條件下緩慢研磨3～5 min，勻漿液在低溫冷凍離心機中3 000 r/min離心10 min，用潔凈的、消毒過的棉簽清除勻漿液表層脂質(zhì)，小心吸取離心后上清液，分裝編號，于-80 ℃條件下儲存待測。

1.5 肝胰臟透射電鏡切片

取出草魚肝胰臟，用PBS沖洗3遍，切取1 mm左右的肝胰臟于2.5%戊二醛固定4 h以上，然后用PBS漂洗2次，每次1 h，再經(jīng)1%鋨酸固定1 h，PBS漂洗2次，每次5 min，后乙醇脫水。樣本用1,2-環(huán)氧丙烷漂洗2次，每次漂洗10 min，環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂(1∶1)混勻后，將樣本浸沒其中，靜置1 h后包埋在帶標簽紙的模型中，放置過夜后放入60 ℃烘箱48 h，然后切片(透射電鏡50～60 nm)，染色(透射電鏡:1%鈾染色10 min)，最后進行圖片采集和分析(每組9個樣本)。

1.6 指標測定

1.6.1 生長性能指標測定

記錄初始體重(initial body weigh，IBW)、終末體重(final body weight，F(xiàn)BW)，飼料攝入量等數(shù)據(jù)，計算增重率(weight gain rate,WGR)、飼料系數(shù)(feed coefficient,FC)、臟體指數(shù)(viscerosomatic index,VSI)、肥滿度(condition factor,CF)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)、成活率(survival rate,SR)，計算公式如下：

WGR(%)=[(We-Ws)/Ws]×100；FC=(We-Ws)/Wf；VSI(%)=(Wv/We)×100；CF(g/cm3)=We/L3；PER(%)=[(We-Ws)/Wp]×100；SR(%)=(ne/ns)×100。

式中：We為FBW(g)；Ws為IBW(g)；t為試驗持續(xù)時間(d)；Wf為飼料干物質(zhì)攝入量(g)；Wv為內(nèi)臟重(g)；L為體長(cm)；Wp為飼料中粗蛋白質(zhì)含量(%)；ne、ns分別為草魚養(yǎng)殖期間終末和初始魚尾數(shù)。

1.6.2 全魚營養(yǎng)成分測定

草魚全魚水分含量測定采用105 ℃恒溫烘干失重法(GB 5009.3—2010)；粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)；粗脂肪含量測定采用索氏抽提法(GB 5009.4—2010)；粗灰分含量測定采用馬福爐高溫灼燒法(GB 5009.4—2010)。

1.6.3 脂質(zhì)代謝指標測定

脂質(zhì)代謝指標血清和肝胰臟甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量及肝胰臟肝脂酶(HL)、脂蛋白脂酶(LPL)、總脂酶(TL)活力測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書測定脂質(zhì)代謝指標。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，若差異顯著，進一步進行Duncan氏法多重比較，差異顯著水平設定為P<0.05,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 高脂飼料中添加CGA對草魚生長性能的影響

由表2可知，各組草魚終末體長、臟體指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；隨著CGA添加水平的提高，終末體重、增重率、蛋白質(zhì)效率均顯示出先升高后下降的趨勢，400CGA組最高，與C組差異顯著(P<0.05)，其中終末體重增加15.90%，增重率提高22.96%，蛋白質(zhì)效率提升17.75%；與C組對比，試驗組飼料系數(shù)呈現(xiàn)集體下降，400CGA組顯著低于C組(P<0.05)，降低了14.86%；魚體肥滿度隨著CGA添加水平提高而升高，600CGA組顯著高于C組(P<0.05)；各組草魚存活率均為100%。

表2 高脂飼料中添加CGA對草魚生長性能的影響Table 2 Effects of chlorogenic acid supplementation in high-fat diets on growth performance of grass carp

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 高脂飼料中添加CGA對草魚全魚營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，各組全魚水分含量無顯著差異(P>0.05)；400CGA組全魚粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他組且粗脂肪含量顯著低于其他組(P<0.05)；C組全魚粗灰分含量顯著高于400CGA組(P<0.05)。

表3 高脂飼料中添加CGA對草魚全魚營養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of chlorogenic acid supplementation in high-fat diets on conventional nutrient composition of whole body of grass carp

2.3 高脂飼料中添加CGA對草魚血清及肝胰臟中脂質(zhì)指標的影響

2.3.1 血清中脂質(zhì)指標

由表4可知，草魚血清中各組的TG含量差異不顯著(P>0.05)；C組血清T-CHO含量顯著高于200CGA、400CGA組(P<0.05)，與600CGA組差異不顯著(P>0.05)；C組血清HDL-C含量顯著低于各試驗組(P<0.05)；C組血清LDL-C含量顯著高于400CGA、600CGA組(P<0.05)，與200CGA組差異不顯著(P>0.05)。

表4 高脂飼料中添加CGA對草魚血清中脂質(zhì)指標的影響Table 4 Effects of chlorogenic acid supplementation in high-fat diets on lipid indicators in serum of grass carp mol/L

2.3.2 肝胰臟中脂質(zhì)指標

由表5可知，C組肝胰臟中TG、T-CHO含量顯著高于其余各組(P<0.05)，400CGA、600CGA組肝胰臟中HDL-C含量顯著高于C組(P<0.05)，但C組與200CGA組差異不顯著(P>0.05)；C組肝胰臟中LDL-C含量顯著高于其余各組(P<0.05)。

表5 高脂飼料中添加CGA對草魚肝胰臟中脂質(zhì)指標的影響Table 5 Effects of chlorogenic acid supplementation in high-fat diets on lipid indicators in hepatopancreas of grass carp mol/mg prot

2.4 高脂飼料中添加CGA對草魚肝胰臟中脂質(zhì)代謝酶活力的影響

由表6可知，試驗組肝胰臟中HL活力顯著高于C組(P<0.05)；400CGA組肝胰臟中LPL活力顯著高于C組(P<0.05)；試驗組肝胰臟中TL活力均顯著高于C組(P<0.05)。

表6 高脂飼料中添加CGA對草魚肝胰臟中脂質(zhì)代謝酶活力的影響Table 6 Effects of chlorogenic acid supplementation in high-fat diets on lipid metabolism enzyme activities in hepatopancreas of grass carp U/mg prot

2.5 高脂飼料中添加CGA對肝胰臟細胞中脂質(zhì)沉積的影響

組織切片中肝胰臟細胞脂質(zhì)經(jīng)鋨酸還原后呈黑色，見圖1。由圖可知，C組脂滴分布密集，數(shù)量較多，且體積較大，大量脂質(zhì)沉積于肝胰臟細胞中；與C組相比，試驗組脂滴的體積都明顯變小，且脂滴的分布也較稀疏，脂質(zhì)沉積變少，尤以400CGA、600CGA組明顯；進一步比較400CGA和600CGA組可看出，400CGA組中肝胰臟中脂滴數(shù)量、大小、分布密度均小于600CGA組。

圖1 透射電鏡下肝胰臟細胞中脂質(zhì)沉積情況(標尺：5 μm)Fig.1 Lipid deposition in hepatopancreas under transmission electron microscope (scale： 5 μm)

3 討 論

3.1 高脂飼料中添加CGA對草魚生長性能的影響

CGA作為脂類物質(zhì)，在胃和小腸中以原型的方式被吸收，進入血液后發(fā)揮其抗氧化和降脂等作用[21-22]。目前，CGA對畜禽的促生長、抗氧化、降脂、降糖等作用已被廣泛關注，且CGA作為飼料新型添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用研究已有零星報道。肖洋[23]報道飼料中添加200 mg/kg CGA能夠提高中華鱉生長性能；張純[18]研究表明，建鯉飼料中添加200 mg/kg CGA顯著提高了建鯉魚體的增重率，且CGA對腸道發(fā)育具有促進作用，建鯉生長性能改善可能與此有關。本試驗結果顯示，與C組對比，添加400 mg/kg CGA顯著提高了草魚終末體重、增重率和蛋白質(zhì)效率，其中草魚終末體重增加15.90%，增重率提高22.96%，蛋白質(zhì)效率提升17.75%，飼料系數(shù)顯著降低了14.86%；肥滿度隨著CGA添加水平提高呈現(xiàn)緩慢提升趨勢，添加600 mg/kg CGA顯著提高了肥滿度。由以上試驗結果可知，400 mg/kg CGA的添加使草魚生長性能得到提高，可較好促進草魚生長。本試驗與上述相關研究結果在獲得較好生長性能的添加水平上不盡相同，分析原因可能與魚的種類、飼養(yǎng)周期、飼料中營養(yǎng)成分含量以及CGA來源等有關。

3.2 高脂飼料中添加CGA對草魚全魚營養(yǎng)成分的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，高脂飼料中添加CGA對全魚粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分含量均產(chǎn)生顯著的影響，400CGA組全魚粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其他組，說明添加400 mg/kg CGA促進了草魚對飼料蛋白質(zhì)的利用，這一結果與朱衛(wèi)等[24]在點籃子魚中研究結果有所差異。羅非魚、比目魚、鱸魚研究報道發(fā)現(xiàn)，飼料中所含粗脂肪含量過高時，多余的未被代謝脂肪會沉積于魚體內(nèi)[6-7,25]。本試驗中，400CGA組全魚粗脂肪含量顯著低于其余組，表明添加400 mg/kg CGA可有效地降低魚體脂質(zhì)的沉積。CGA的添加均可降低全魚粗灰分含量，且C組顯著高于400CGA組，究其原因可能是C組缺乏CGA輔助草魚機體脂質(zhì)代謝，致使魚體脂質(zhì)沉積增加，而多余的脂質(zhì)可促進機體對維生素A、維生素D、維生素E、維生素K的吸收，并在機體內(nèi)沉積大量的能量源物質(zhì)[26]，并且這些脂溶性維生素參與魚體多種生理生化反應，從而增加了魚體的無機鹽沉積，導致了粗灰分含量增高，目前這一推測還有待論證。本試驗中，與C組相比，添加400 mg/kg CGA對全魚粗脂肪、粗蛋白質(zhì)含量均有顯著影響，說明高脂飼料中添加400 mg/kg CGA可以有效地提高草魚的營養(yǎng)價值。

3.3 高脂飼料中添加CGA對草魚脂質(zhì)代謝的影響

3.3.1 血清和肝胰臟中脂質(zhì)代謝

Shimoda等[27]報道了口服CGA可減少大鼠內(nèi)臟脂肪的蓄積，降低大鼠機體脂質(zhì)含量；De Sotillo等[28]通過給予小鼠靜脈注射CGA，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟和血漿中的TG含量顯著下降；Frank等[29]研究也證明，在大鼠飼料中加入CGA后，降低了肝臟的T-CHO含量；張?zhí)m濤等[30]發(fā)現(xiàn)灌服20 mg/mL的CGA可顯著降低小鼠肝臟、骨骼肌TG含量；王強等[31]報道了金銀花提取物CGA能有效降低血清和肝臟的T-CHO的含量。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加CGA有效地降低了血清中T-CHO、LDL-C含量以及提高了血清中HDL-C含量，由此可知CGA的添加對血清中脂質(zhì)代謝具有良好的調(diào)節(jié)作用，且400CGA組以上3個指標均表現(xiàn)出顯著變化，故認為添加400 mg/kg CGA可有效調(diào)節(jié)血清中的脂質(zhì)代謝。CGA對草魚肝胰臟的降脂作用亦體現(xiàn)較為明顯，本試驗條件下，C組草魚肝胰臟中的TG、LDL-C含量均顯著高于試驗組，而肝胰臟中HDL-C含量則顯著低于400CGA、600CGA組，與200CGA組差異不顯著，同樣說明添加CGA可促進肝胰臟脂質(zhì)代謝，此試驗結果與Shimoda等[27]、De Sotillo等[28]的研究結果基本一致，均證實CGA對脂質(zhì)代謝具有較好的調(diào)節(jié)作用。

本試驗結果顯示，添加400和600 mg/kg CGA均可增強脂質(zhì)代謝能力，根據(jù)400CGA、600CGA組試驗結果中相關脂質(zhì)代謝指標的含量，與C組結果對比，探討最佳添加水平。400CGA組血清中T-CHO、HDL-C、LDL-C含量的變化均達到顯著水平，故認為添加400 mg/kg CGA對血清中脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)能力最佳。400CGA、600CGA組各項肝胰臟脂質(zhì)代謝指標均顯示出與C組的顯著差異，與C組相比，400CGA組肝胰臟中TG、T-CHO、LDL-C分別降低了64.73%、47.05%、57.95%，肝胰臟中HDL-C含量提高了74.95%，600CGA組肝胰臟中TG、T-CHO、LDL-C分別降低了60.07%、41.16%、45.35%，肝胰臟中HDL-C含量提高了76.04%，由此可見，400 mg/kg CGA對肝胰臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用強于600 mg/kg CGA。綜合得出，400 mg/kg CGA的對血清和肝胰臟的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用較好。

3.3.2 肝胰臟中脂質(zhì)代謝酶

LPL主要作用是分解乳糜微粒、極低密度脂蛋白和中密度脂蛋白中的TG為游離脂肪酸和甘油，以供機體組織儲存和氧化利用[32]。HL主要分解乳糜殘粒中的TG，并參與高密度脂蛋白的重構、極低密度脂蛋白的代謝以及T-CHO的逆向轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)[33]。本試驗中，添加CGA可有效地提高肝胰臟中脂質(zhì)代謝酶的活力，且在400CGA組與C組差異達顯著水平，與C組組對比，400CGA組肝胰臟中LPL、TL、HL活力分別提高了57.95%、74.95%、86.24%，可知添加400 mg/kg CGA可大幅提高肝胰臟脂質(zhì)代謝酶活力，且添加400 mg/kg CGA使肝胰臟中TG、T-CHO含量顯著降低，推測此結果可能是CGA添加致使肝胰臟LPL與HL活力升高，促進肝胰臟中TG分解為游離脂肪酸，從而降低肝胰臟中TG、T-CHO含量。由此可知，添加400 mg/kg CGA可增強草魚肝胰臟在高脂環(huán)境下的脂質(zhì)代謝能力。

3.3.3 高脂飼料中添加CGA對草魚肝胰臟細胞中脂質(zhì)沉積的影響

鋨酸與脂質(zhì)反應生成黑色鋨和脂質(zhì)復合物，不溶于固定過程中的二甲苯等有機溶劑，因而鋨酸染色能精確的顯示細胞中脂肪滴的大小及數(shù)量[34]。本試驗中，肝胰臟切片鋨酸染色后經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，C組脂滴數(shù)量較多且脂滴體積也相對較大，脂滴密集分布于肝細胞中，表明在肝胰臟中有大量的脂質(zhì)沉積，長期飼喂高脂飼料使草魚肝胰臟產(chǎn)生了嚴重的脂質(zhì)代謝負擔，若不能及時降解肝胰臟中的脂質(zhì)，易使脂質(zhì)大量沉積在肝胰臟組織中，造成營養(yǎng)性脂肪肝等疾病，影響肝臟正常生理功能[35]。與C組相比，試驗組脂滴體積都明顯較小，且分布較稀疏，說明高脂飼料中添加CGA降低了肝胰臟中脂質(zhì)含量，減少脂肪沉積，尤其以400CGA和600CGA組最為明顯。進一步觀察比較，400CGA組中肝胰臟中脂滴數(shù)量、體積大小、分布密度均小于600CGA組，可知400CGA組肝胰臟脂質(zhì)沉積少于600CGA組，CGA添加水平為400 mg/kg時肝胰臟脂質(zhì)代謝能力優(yōu)于添加水平為600 mg/kg時。由此可以說明，高脂飼料中CGA添加水平為400mg/kg時能促進肝胰臟脂質(zhì)代謝。

4 結 論

本試驗條件下，草魚幼魚階段的高脂飼料中添加CGA 400 mg/kg可增強草魚脂質(zhì)代謝能力，促進草魚生長。